非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及非小细胞肺癌分子标志物相关探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒。利用本发明提供的方法制备的EGFR基因探针和ERCC1基因探针，结合杂交缓冲液、未标记的竞争性DNA及DAPI复染剂可以制备一种非小细胞肺癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒，实现EGFR和ERCC1两种指标的联合检测，有助于非小细胞肺癌的预后判断和疗效预测，可用于指导个体化治疗方案制定，选择合适治疗方法，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。

主权项

一种EGFR基因探针和ERCC1基因探针的制备方法，其特征在于2种基因探针的制备步骤包括：(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有EGFR基因和ERCC1基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆；(2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买克隆Invitrogen RPCI11.C，取10μl克隆菌液添加到5ml含氯霉素抗性的TB培养液中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml含氯霉素抗性的TB培养液中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对EGFR基因探针和ERCC1基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定；(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，获得探针，避光、‑20±5℃储存；(4)基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。