快速诊断家畜日本血吸虫病试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开了一种快速诊断家畜日本血吸虫病的试纸条。本发明的试纸条由抗SEA抗体和SEA包被硝酸纤维膜作为质量控制线和检测线，用胶体金标记SEA抗原，利用双抗原夹心法制成。本发明特异性强、灵敏度高，操作简便快速。制备成本低、适宜于规模型生产。

主权项

一种诊断家畜日本血吸虫病试纸条的制备方法，该方法包括下列步骤：(1)日本血吸虫可溶性虫卵抗原的制备用盖玻片法于新西兰大白兔腹部感染2000～2500条日本血吸虫尾蚴，于42天杀兔，取肝脏除去胆管、血管及结缔组织，用4℃预冷的1％NaCl溶液洗净血污，剪碎加600mL的PBS，匀浆器匀浆粉碎后，分别过40目、80目、120目、160目、200目分离筛，取筛下物再用260目尼龙筛集卵，沉渣用PBS稀释后，3500rpm5min反复离心，弃去上清和上层肝泥，直至沉淀呈金黄色，显微镜下观察至背景干净为止，再以12000rpm离心30秒，吸去上层水溶液，下层虫卵于液氮/自来水条件下反复冻融数次，加适量PBS，研磨，冰浴条件下超声处理6次，每次30sec，间隔2min，4℃40000g离心1hr，取上清液，用去离子水透析2天，每天换3次水；透析去盐后的上清液即为纯净的日本血吸虫可溶性虫卵抗原，分装于‑20℃保存备用；(2)抗日本血吸虫可溶性虫卵抗体的制备用日本血吸虫可溶性虫卵抗原与206佐剂按重量比1∶1混合，以每次1mg抗原剂量，腿部肌肉注射免疫新西兰白兔，三免后耳静脉采血，双向琼脂扩散法测定抗体滴度，当抗体滴度达到1∶32以上时剖杀兔子采血，收集并分离血清，用硫酸铵盐析法纯化，在4℃PBS中透析至无NH4+或是无SO42‑为止，CBB‑SDS法测定浓度后分装，‑20℃保存备用；(3)缓冲液、封闭液、稳定剂、均浆剂的配制0.01M磷酸盐缓冲液：KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 17.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，定容至1000ml，调pH至7.4；0.01M Tris‑HCl缓冲液：1.414g Tris溶于1000mL去离子水中，用HCl调pH至7.4；封闭液：3g脱脂奶粉溶于100mL 0.01M的Tris‑HCl中；稳定剂：1g BSA溶于100mL Tris‑HCl中；均浆剂：3g蔗糖溶于100mL Tris‑HCl中；(4)胶体金探针的制备取500uL 1％的柠檬酸三钠加入煮沸的0.005％氯金酸中，待溶液煮至酒红色后继续煮5min制备得到40nm的胶体金，冷却后用0.2M的碳酸钾调节胶体金pH至7.0～7.5；在磁力搅拌下于调好pH值的10mL胶体金溶液中逐滴加入1mL用pH7.4的0.01MTris‑HCl稀释至80ug/mL的日本血吸虫可溶性虫卵抗原，搅拌10min后加入稳定剂1mL，继续搅拌10min，12000rpm，4℃离心20min，弃上清，稳定剂重悬沉淀，同上法离心，反复洗离3次后加稳定剂重悬至2mL，加10％的NaN3终浓度为0.2％，后于4℃保存； (5)金标垫制备将玻璃纤维用均浆剂浸泡片刻，37℃干燥30min；将日本血吸虫可溶性虫卵抗原‑胶体金探针加于XYZ3200喷点机中，以10uL/cm2喷于玻璃纤维上，低温冻干，装入铝箔袋中密封，4℃～20℃保存备用；(6)NC膜的包被选用孔径为5um，爬速为120～160sec/4cm的NC膜，用pH7.4的0.01M Tris‑HCl溶液将日本血吸虫可溶性虫卵抗原稀释至1.5mg/mL、抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原抗体稀释至3.2mg/mL，分别加于ZX1000喷膜机中以1uL/cm喷膜，37℃干燥5min，用含3％脱脂奶粉的封闭液封闭30min，并用0.01M Tris‑HCl洗脱液飘洗3次，37℃烘干30min，密封后装入含干燥剂的铝箔袋中密封，4～20℃保存备用；(7)试纸条的组装将吸水纸、包被好的NC膜、金标垫、另一吸水玻璃纤维从上到下依次固定在双面胶塑料底板上，用裁剪刀或切条机切成25×50mm的试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封，于4～20℃保存。