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一种溶藻弧菌HSP70重组DNA核酸疫苗的构建方法，其特征是：利用其他弧菌已知序列设计引物,PCR扩增HSP70的ORF部分序列，再进行TA克隆和序列测定，然后进行pcDNA3.1重组DNA核酸疫苗的构建并鉴定构建的成功；其步骤如下：（1）Primer Premier 5.0软件设计引物：P1：5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'；P2：5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；PCR扩增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反应体系(25 μl)：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/μl)2 μl，Taq酶0.2 μl，引物P1、P2各0.25 μl，DNA template 1 μl，加灭菌三蒸水至总体积25μl；PCR反应参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min；用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver.2.0介绍的方法回收纯化PCR产物；（2）回收目的基因片段并与PMD18‑T Easy载体以3：1的体积比连接；连接体系: Ligation Mix 5.0 μl，目的片段4.5 μl，PMD18‑T Vec‑tor 0.5 μl，16℃反应30分钟，需要时放入4℃冰箱保存；连接产物转化感受态E. coli DH5α，碱裂解法少量制备质粒DNA；PCR及EcoRⅠ和XholⅠ双酶切鉴定；反应体系：ddH20 8μL;10×buffer2μL;EcoRⅠ(15U/μL)1μL; XholⅠ1μL;质粒DNA 8μL；37℃水浴2小时；1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果；（3）分别用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切真核表达载体pcDNA3.1和TA克隆质粒, 均在酶切体系中进行； 37℃水浴3小时后凝胶电泳回收；将酶切的质粒用一个柱子回收；最后用30～40ul的Elution Buffer溶解，然后取1ul定量；跑完电泳后与MAKER比较以确定1ul中有多少ng的产物；回收后的产物应迅速放入‑20℃保存；酶切体系为：在40ul质粒加入6ul的10 X H Buffer，4ulECOR1,4ulXhol，再加入6ul的水；（4）1%琼脂糖凝胶上电泳,利用大质粒提取试剂盒切胶回收酶切后的pcDNA3.1片段和HSP70片段, 按照摩尔比1：6的比例建立一个20ul的连接体系，体系中包含2ul的T4Ligase Buffer，2ul T4Ligase，然后是各l ul目的片段和载体，用水补齐20ul，15℃过夜连接；转化DH5α大肠埃希菌，挑单个菌落；（5）PCR初步筛选阳性克隆,碱裂解法提取质粒,按照上述方法用EcoRⅠ和XholⅠ酶切、测序鉴定，目的DNA片段连接、转化正确，表明pcDNA3.1重组DNA核酸疫苗的构建成功。 |
