基于核酸内切酶消化的甲基化DNA检测方法

摘要

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤包括：步骤1，亚硫酸盐处理待测DNA和标准甲基化DNA和非甲基化DNA；步骤2，合成带有尾引物序列的PCR引物；步骤3，扩增标准甲基化DNA和非甲基化DNA样品，并测定扩增产物解链温度；步骤4，扩增待测DNA样品；步骤5，对待测DNA扩增产物进行加热至一特定温度；步骤6，进行消化；步骤7，以带有荧光标记的尾引物进行第二次PCR扩增；步骤8，测定电泳迁移率，判定样品中是否含有甲基化DNA。本发明甲基化DNA检测方法，具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点，在多种肿瘤疾病的早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

主权项

一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段含多个CpG位点的序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选连续序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T7启动子序列作为T7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段20个碱基长度的T3启动子序列作为T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；步骤3，亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶、荧光染料，用所述正向和反向PCR引物，在实时定量PCR扩增仪中分别进行扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；步骤4，用所述PCR引物，在与步骤3相同的条件下对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于非标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，加入单链DNA特异性核酸内切酶进行消化，得到消化产物；步骤7，以步骤6所得的经消化后的PCR产物为模板，加入T3尾引物和带有荧光标记的T7尾引物、DNA聚合酶进行第二次PCR扩增；用核酸分析仪测定PCR扩增产物DNA片段在毛细管电泳的迁移率；步骤8，将步骤7所测结果与标准样品对照，如果待测样品中出现与甲基化DNA标准样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA；反之，则不存在。