一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

摘要

一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。本发明包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝多糖的部分水解、灵芝多糖部分水解产物的PMP衍生化反应、反相HPLC指纹分析及其标准指纹图谱的确定。通过对15个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖成分的HPLC分析及其指纹图谱的比较，确定了其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。指纹图谱有峰19个，共有峰峰面积之和占总峰面积的98%，峰面积超过总峰面积5%的指纹峰4个。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子粉多糖质量情况及产地来源，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。

主权项

一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的部分水解、灵芝孢子粉多糖部分水解产物的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮PMP衍生化反应、反相高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；步骤为：（1）灵芝孢子粉多糖的提取：(a)对于破壁灵芝孢子粉：准确称取破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60~80℃功率300瓦超声30~60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50~60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测；或(b) 对于未破壁灵芝孢子粉：准确称取未破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于90~95℃水浴振荡恒温浸提2~3小时，再于水浴60~80℃功率300瓦超声30~60min，以下操作同(a)；（2）灵芝孢子粉多糖的部分水解：吸取100μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L 三氟乙酸TFA，充N2封管，100℃水解1 h；冷却后打开盖，真空干燥或用N2吹干，以去除TFA，再加200μL超纯水溶解水解产物，备用；（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的PMP衍生化反应：取步骤（2）部分水解后超纯水溶解的水解产物100μL，加100μL 0.6M NaOH溶液，混匀；取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加等体积50μL的0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中反应30~100 min，取出放置10min冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，重复萃取共3次；将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析；（4）反相高效液相色谱的指纹分析：反相高效液相色谱分析条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB‑C18，250mm×4.6 mm i.d., 5μm；流动相：pH 6.7的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液‑乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为78~83∶22~17；柱温：20~35℃；检测波长：245~254 nm；流速：0.8~1 mL /min；进样体积：10~50μL；在此条件下进样分析步骤（3）过滤后的PMP衍生化产物，得到灵芝孢子粉多糖的高效液相色谱指纹图谱；（5）标准指纹图谱的确定：通过15个不同产地的灵芝孢子粉样品中的多糖水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰为 19个；所述的19个共有特征峰以葡萄糖峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于2 %；即：1号峰平均RT为0.468，RSD为 0.40%；2号峰平均RT为0.490，RSD为 0.10%；3号峰平均RT为0.508，RSD为 0.31%；4号峰平均RT为0.523，RSD为 0.23%；5号峰平均RT为0.544，RSD为 0.10%； 6号峰平均RT为0.577，RSD为 0.12%；7号峰平均RT为0.603，RSD为 1.05%； 8号峰平均RT为0.647，RSD为 0.77%；9号峰平均RT为0.669，RSD为 0.10%；10号峰平均RT为0.725，RSD为 0.19%；11号峰平均RT为0.774，RSD为 0.08%；12号峰平均RT为0.842，RSD为 0.07%；13号峰平均RT为0.876，RSD为 0.21%；14号峰平均RT为0.912，RSD为 0.08%；15号峰平均RT为1.000，RSD为0；16号峰平均RT为1.131，RSD为0.06%；17号峰平均RT为1.215，RSD为0.09%；18号峰平均RT为1.256，RSD为0.09%；19号峰平均RT为1.482，RSD为0.07%；其中超过总峰面积5%的指纹峰有4个，分别为：2号峰甘露糖，相对峰面积5.12%~9.11%；15号峰葡萄糖，相对峰面积20.94%~48.47%；16号峰半乳糖，相对峰面积10.38%~54.41%；19号峰岩藻糖，相对峰面积5.19%~14.31%。