谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及生物工程领域，公开了一种融合蛋白表达载体。将谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)C端与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的N端相连，构建在真核生物表达载体pBK-CMV(Δ[1098-1300])上，得到谷氨酰胺转运蛋白2-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体。通过这种载体，可用激光共聚焦电子显微镜和利用GFP抗体通过蛋白免疫印记技术(Western blot)检测SNAT2在哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)膜上的表达、定位及定量的方法。

主权项

谷氨酰胺转运蛋白2‑加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PCR扩增并纯化回收谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)基因片段和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段，SNAT2基因片段用XbaI酶和BlpI酶进行酶切，EGFP基因片段用BlpI酶和NotI酶进行酶切；用XbaI酶和NotI酶酶切含有SNAT2基因片段的真核表达载体质粒pBK‑CMVΔ‑SNAT2‑myc；并回收pBK‑CMVΔ载体大片段；(2)用T4DNA连接酶将酶切纯化的SNAT2基因片段、EGFP基因片段和pBK‑CMVΔ载体大片段在15～18℃下恒温保持14～18小时进行连接；(3)用连接产物转化感受态细胞，卡那霉素筛选，挑取重组体单菌落培养并鉴定。