从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法

摘要

本发明公开了浙江枝吻纽虫体壁通过RNA提取、cDNA合成、酶切、连接转化、重组质粒转化、重组蛋白诱导表达和重组蛋白的分离纯化，cDNA合成后用适合的双酶切引物进行PCR扩增得到目的片段的PCR产物，对引物和适合的表达载体双分酶切后连接，再转化到适合的宿主，分离纯化采用Ni-NTAHis.BindResin试剂盒的改进操作的方法，在非变性的条件下进行，从而省却了繁琐的复性步骤，也更有利于保持重组蛋白的天然活性，得到纯度较高的重组凝溶胶蛋白，本法制备的重组凝溶胶蛋白以可溶性的形式存在，且浓度约为85%，对肿瘤细胞呈现出明显的抑制作用，本发明的方法科学合理，简便易行，易于推广。

主权项

从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法，其特征在于包括下述步骤：a、RNA提取：清洗浙江枝吻纽虫得到浙江枝吻纽虫体壁，将浙江枝吻纽虫体壁速冻于液氮中，研磨成粉，然后用RNAiso plus RNA提取试剂盒提取总RNA，具体方法依照试剂盒说明进行操作； b、cDNA合成：将提取的总RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，然后用下述引物进行PCR扩增：CGGGATCCAT GTCTGGACTT GTAAAA和CCCAAGCTTT CAAGCCATGA GTGTCTT； PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 10 min， PCR扩增后，用胶体金回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，切胶回收得到含纽虫凝溶胶蛋白的目的片段的PCR产物；c、酶切：目的片段双酶切体系为：13 μl上述PCR产物，1 μl BamHⅠ酶，1 μl Hind Ⅲ酶，2 μl 10×K缓冲液，加水补到总体积为20μl，37℃作用2 h，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的目的片段；pET28a（+）载体的双酶切体系为：2 μlpET28a（+）载体，0.5 μl BamHⅠ酶，0.5 μl Hind Ⅲ酶，1 μl 10×K 缓冲液，加水补到总体积为10μl，37℃作用2 h，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的pET28a（+）表达载体； d、连接转化：将上述酶切后的目的片段与酶切后的pET28a（+）表达载体进行连接，具体连接体系为：酶切后的目的片段7μl，酶切后的pET28a（+）表达载体1μl，T4 DNA ligase buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，16℃连接过夜，连接结束后，转化至E. coli DH5α中，得到含目的片段‑pET28a（+）的E. coli DH5α质粒； e、重组质粒转化：将上述含目的片段‑pET28a（+）的E. coli DH5α质粒涂布于含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，挑取阳性克隆，进行PCR检测并测序，序列比对后，提取序列正确的重组质粒重新转化至E. coli BL21（DE3），得到含目的片段‑pET28a（+）E. coli BL21质粒； f、重组蛋白诱导表达：将上述含目的片段‑pET28a（+）E. coli BL21质粒接种到含50μg/ml 卡那霉素的LB培养基上，37℃，120 r/min振荡培养至生长对数期为A600=0.6‑0.8，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37℃诱导4 h，菌液经12000 r/min，离心5 min后，弃上清，菌体沉淀冻存备用；g、重组蛋白的分离纯化：将上述步骤f得到的菌体采用Ni‑NTA His. Bind Resin试剂盒进行分离纯化，具体操作按照试剂盒说明并进行简单改进：3ml菌体沉淀悬浮于200μl 的Wash Buffer溶液中，该Wash Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl和 10 mM imidazole，在4℃，400 W，5‑10 min超声破碎，然后在12000 r/min，离心10 min，取上清加入50μl 的Ni‑NTA Agarose，用250μl的 Wash Buffer溶液分三次洗涤，洗去非特异性结合的杂蛋白；然后用25μl的Elution Buffer溶液分三次洗脱，得到洗脱液，Elution Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl和250 mM imidazole，洗脱液装入透析袋中，加入pH7.5，Tris‑HCl浓度为50 mM的透析液，所述洗脱液与所述透析液的体积比为1：100，在4℃透析过夜亲和，层析，分离纯化，得到重组凝溶胶蛋白。