一种大片段DNA克隆载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种简单快捷构建克隆载体的方法，简称LJY法和用此方法已构建好的4个克隆载体。本发明以pBR322的AmpR基因和ori复制起始点为骨架，通过独特的引物设计方法和平端连接，可简单快速地在新构建的克隆载体质粒中引入所需的限制性内切酶识别位点，并有效地提高载体的外源基因容量和稳定性，避免大片段基因克隆时常出现的目的基因意外突变等问题。

主权项

一种大片段DNA克隆载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)在基准引物VF和VR的5’端添加所需限制性内切酶识别位点并合成扩增引物V1F和V1R；所述基准引物VF和VR序列分别为：VF：5’‑cggaacatgtgagcaaaa‑3’；VR：5’‑cttcaataatattgaa‑3’；(2)以pBR322的AmpR基因和ori复制起始点为载体骨架，用所合成的扩增引物V1F、V1R扩增载体骨架；(3)回收载体骨架片段，溶于3.5μL灭菌的超纯水中，加入反应液1.5μL至终浓度为1mM，孵育；所述反应液为10×T4Polynucleotide Kinase buffer 0.5μL、T4 PolynucleotideKinase 5U和ATP 0.5μL；(4)加入5μL DNA Ligation Kit(Mighty Mix)，进行平端连接；(5)取(4)连接产物转化入DH5α感受态细胞中，涂布Amp+的LB平板培养基后，于37℃培养14～16h，挑取单菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中37℃振荡培养5～6h；(6)以扩增引物V1F和V1R为检测引物，对可疑菌落进行菌落PCR检测，取可疑质粒，人为引入特异性限制性内切酶进行酶切鉴定或测序鉴定，最终得到的阳性重组质粒即为目的载体质粒。