犬CaIFN-α基因的表达质粒的构建方法及用途

摘要

本发明以抗辐射菌-大肠杆菌间的穿梭载体为基础，与抗辐射菌Deinococcus radiodurans由来的具有活性的groEL启动子及犬CaIFN-α基因片段重组，构建成具有CaIFN-α表达活性的质粒，并以抗辐射菌Deinococcus grandis为宿主，-射线辐照诱导等，高效表达生产具有生物活性的犬CaIFN-α。本发明较好地解决了犬CaIFN-α在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定、在哺乳动物培养细胞中表达生产的成本太高，以及用家蚕幼虫表达受季节限制，不能周年生产的缺点。

主权项

犬CaIFN α基因的表达质粒的构建方法，其特征是包括以下步骤：1)、穿梭载体质粒的构建：用QIAfilter Plasmid kit从抗辐射菌Deinococcus radiopugnans中提取质粒pUE30并进行Sph I酶切，用Sph I消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性的Amp抗性基因、抗辐射菌Deinococcus radiodurans中有活性的氯霉素抗性基因的质粒pKatCAT，再与上述pUE30的Sph I消化物混合，用DNA连接酶连接；采用电穿孔法将上述连接物转化大肠杆菌JM109株，从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连接的质粒的株，获得穿梭载体质粒pZT29；2)、CaIFN α基因的克隆；获得纯化的犬CaIFN α基因；3)、CaIFN α基因表达质粒的构建：设计包含限制性内切酶Cla I位点的DNA损伤修复基因rec A的groEL启动子的引物，PCR增幅groEL启动子，在上述穿梭载体质粒的Cla I酶切位点插入groEL启动子构建得到转化子pZT66；进一步用限制性内切酶EcoT221消化上述转化子pZT66，用T4DNA polymerase进行DNA片断末端的平滑化，将上述纯化的犬CaIFN α基因顺向插入上述质粒的EcoT221位点，形成犬CaIFN α基因的表达质粒。