一种秦艽悬浮细胞的培养工艺

摘要

本发明公开了一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，取秦艽叶片诱导得愈伤组织后对其进行增殖培养，继代培养获得松散的适合悬浮培养的愈伤组织细胞系，在获得对数生长期种细胞之后，进行秦艽悬浮细胞培养，在收获细胞之后再提取生产次生代谢产物。本发明提供的秦艽悬浮细胞的培养工艺，细胞生长速度快，分散性好，所得悬浮细胞的生物量达15.23g/L.月(干细胞)，龙胆苦苷含量达0.034％。在培养液中添加诱导子之后，可提高次生代谢产物的产量：在加入黑曲霉诱导子之后，与未添加诱导子的对照组相比，龙胆苦苷的产量提高了23.99％。

主权项

一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，其特征在于，包括以下步骤：1)将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm2大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含1.5～3.0mg/kg的2，4‑D和0.3～0.6mg/kg的6‑BA的MS固体培养基上，在25～28℃下每天连续光照10～16h，诱导6～8d；2)在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.05～0.2mg/kg的2，4‑D和0.1～1.0mg/kg的6‑BA的MS固体培养基上，在22～28℃下黑暗培养25～32d；3)在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.05～0.5mg/kg的2，4‑D和0.1～1.0mg/kg的6‑BA的MS固体培养基上，于22～28℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为25～32d，继代培养5～8代后获得松散愈伤组织；4)按照每100ml培养液接种4.0～6.0g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含0.5～2.0mg/kg的2，4‑D和0.1～1.0mg/kg的6‑BA的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养12～18d，收集获得种细胞；5)按照每100ml培养液接种4.0～6.0g的比例，将处于对数生长期的种细胞接种于pH为6.5～7.5、包含0.5～2.0mg/kg的2，4‑D、0.1～1.0mg/kg的6‑BA和35～50g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养25～30d之后收获细胞。