一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法，解决聚酯对植物体的伤害，克服基因沉默，提高PHB表达量等问题，包括(1)启动子的克隆及启动子载体的构建；(2)将启动子载体与phbA、phbB、phbC基因相连，构建表达载体；(3)将表达载体导入植物受体中，即可得到转基因植物，启动子为种子特异性启动子，是以蚕豆的总DNA为模板而克隆的Leg基因启动子，具有序列表所示的核苷酸序列，构建的启动子载体为Leg-GUS，构建的表达载体为pSCAB，植物受体是苍耳。培育出的苍耳种子中PHB平均积累量超过鲜重的28％，为转基因植物生产可降解塑料研究提供了可行的方法和经验，开创了我国在转基因植物生产可降解塑料研究的新局面。

主权项

一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法，包括以下步骤：(1)启动子的克隆及启动子载体的构建；(2)将启动子载体与phbA、phbB、phbC基因相连，构建表达载体；(3)将所构建的表达载体导入植物受体中，即可得到转基因植物，其特征是所述启动子为种子特异性启动子，该启动子是以蚕豆的总DNA为模板而克隆的Leg基因启动子，该Leg基因启动子的核苷酸序列为：  1 gtttcactat aaatccctat aagcttcact aggcgagctg cacagcgaag ggttcgctag 61 ttatgatatt atgagtaaac catgaaatca gcgagcaagc tagtttaggc ccttttctgg121 cctttaaggt tagtgccttg cagaataagt cggagtactt cgagaaatgt tttgcaagat181 taatgggcaa attttgaggt atgacagtgt ggttgtaggt ttagacgtgt ggcacattgt241 agatgaacaa caatgtagca cttatttctc attactattt aagtagattt gatttctagt301 agcagacaag acatttgtaa cattatagag gggaaatact caaagtatca atcgtttaga361 gaaaagagtt cattcctaca aaaatgtatt cttgcatcca catttatctt caagcaattt421 aaattaccaa atttttctat ctgcttttcc aactagttag ataagagcaa aaatgtccca481 tattttaatt gcaccttttg taagcatttt atgtctaccg ttttcttaat ccaaacattt541 aaacaaaaca tccggcaaac ttaacactta gttagatttt gtagtcgatc ctgcaagtaa601 acctcaatag gagggtagag attgttcgcg cagaaaaccc gtgcgaacag taacactggt661 gaagtttcct gaatctttgt ctttcaaggc agaaataatg taccgtggag gcaatgttgt721 acttcgtcat gtcattcaca aactgtctct aatgaacttt tagaagatcc aatatgtcat781 ggccatataa atcctcacat agtttatgat tgtgaaactc acacctaacg atcaccttcc841 aaccaataac taaagaaaaa taactcatat actcaacgca gatctcagcc taaaatggca901 tgtcctttga ggatttactg ctttcaaatg tattcttcct tttataatta cctcttctct961 cacaatctaa aatcaattta tctttccaac cctactggcc atttacagta gcagaacgaa1021 cagtcacatc tataatgcca tgttgtttgc caatattttg tgcccagact aatacttcag1081 attgggactc aaatatctgt catttacatc acataaaaag taaactacca atatcacata1141 aagaattgca tacaatcgct acacgaatct gtagatgacc atgccgactc cggaccacac1201 aaataaagca ttttttgaaa ttttggctct gttaccataa atttcaaata tactcaaaat1261 ttccaatata tcgaaaattt gaaaattttc ggtacttgtt gtttgtccac ggaaattttg1321 agaattttcg gtattgtata ttggaattta ttttttttcc gaaaatttcc aaaattctgg1381 tatatgaata cgaaaaacgg agtatcggaa atttcatttt tgtaagtttg aaaaaataaa1441 aattatggaa taaaagtaaa atttgaagtg taaatattag caaggatatt ttaaaaatat1501 ctttgagaga acagccagag caaaatgagt tgaaaaataa gggggtatca gattttattg1561 aaggatcctt tagaattatt tttttaggtc tcaatagatt aagaagttgg cgtctcattg1621 aagcaattaa gtagagaaaa caaaaagaat aaatggaaga agttgaggaa atctatattt1681 acacgatcaa ttagtatgtg ttaagagtca tgtatcatga tcaattagta tgtgttaaag1741 tcttgtatca gataatatat aatccaaata tatttttcta aatgaggaca aatctaacct1801 tacaaataag tgttttagag ttaaattaga ttcaatcaca ttttattttt tattttttga1861 acagtaagaa ataagatcta tattttcttc tctatttgtt tacgtccata caaaaaatgt1921 gcaatgattg tgaaagatgt catgcatatg cagtcaccat atattattta cataaaaaga1981 actacttatt ctttcggcct caaattttac ctaggaatta tgtatgcaaa tatgaaatat2041 tcatggactt ttttcgacca ttctttctct ggaaattact ccctatgttt atagaatttg2101 atttcttttg agtaaattag cactttaaat gtaaaagtat ggcatcttat caaacaaccg2161 gttgatgaaa atttcacatt ttcaggtagt aatatgaaat tgataatgga aagatgatat2221 agtattaata ataaatatat ttgaaaagat aacaataaat gtattatatc tataaattta2281 caaggttctt atatttacat acaaacaaat gcagtaatgt ttcaaacaat atgcagtaag2341 taattaacac tttaatttga aggattaatc aatttggtaa ctgaagtagc taattgaaag2401 tttattcttt ataaatcttt gtaatgcaga atatgtaaga aagaaacatg gagtataaga2461 agtaaagcca tggtcccctg ccaccgattt cagctataag aattgcaagt atgctctttg2521 tctggtaatg gagatgatga agccattagc cacctcctct atcagacata ggtgtaaagc2581 attatgcttc catagccatg caagctgcag aatgtccaat tctcaacatc ccactttcaa2641 tgacgtgtcc aaccttcacc accctctctt ctctataaat taccacttct cattaaggtt2701 ctccgcatca caaccaacat tctcttagta tctctcttca tggctattgc Atgggtgtac2761 gttagcgaca attgcaggca gcatttagtc tgacgcagcg aattaaataa aattatgaaa2821 gcataatttt atagatgtga ttcttattat tttctaatga aaatataaca agtgtgttta2881 aatatctttt aaagagtgaa aataggaaaa aagtatatat gtgtaagaag aaattataca2941 attgtctaat agttacttat aattaaataa aattatgaaa aatcattttt tttaaaacta3001 tcatatgata aaatatgact tattccttca aattagtaat gtaattaaag aatctatttt3061 ttcttattat tttctaatga aaata；所构建的启动子载体为Leg‑GUS，所构建的表达载体为pSCAB，所述的植物受体是苍耳，phbA、phbB和phbC是合成聚‑β‑羟基丁酸酯(PHB)的三个基因；Leg‑GUS是在pB I 121基础上，将CaMV35S启动子置换为蚕豆的Leg启动子构建而成，再通过酶切及连接方法，将phbA、phbB和phbC分别与启动子载体Leg‑GUS和导肽控制的中间质粒pP7SA，pP7Sbh和pP7SC连接，再将pP7SC与pP7SA的插入片断连接得到中间质粒pBICA，然后切下整个插入片段，连入pSB得到含有三个基因片段的种子特异性表达载体pSCAB，然后将种子特异性表达载体pSCAB转入根癌农杆菌LBA4404，再转化至苍耳。