柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物

摘要

本发明公开了一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其中所述偶联方法中1)层析介质优选阳离子交换介质；2)层析柱柱床高度优选推荐柱高的上限；3)rhG-CSF蛋白的上样量优选为介质实测最大载量的30-50％；4)以较低的上样流速、较长的上样时间(3～5小时)、较高反应率的pH值上样活化的mPEG；5)活化的mPEG的上样量按活化的mPEG与rhG-CSF的反应量比为1～50mo1∶1mol进行；6)以0.5M～1M氯化钠盐溶液梯度洗脱。本发明还公开了所述方法制得的偶联化合物，即聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其结构式为：CH3-(CH2CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhG-CSF或CH3-(CH2-CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhG-CSFm，式中n为570～2200，r为1～3；以及所述偶联化合物作为制备防治粒细胞减少症制剂的应用。

主权项

一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，步骤包括：选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于5～6倍柱体积的pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以8～10ml/min的流速，将rhG‑CSF或rhG‑CSFm原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％；再在13～15ml/min的流速下，用5～6倍柱体积的pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按mPEG∶rhG‑CSF或rhG‑CSFm的反应量比为2～20mol∶1mol的比例，以0.5～3ml/min的流速上样加入分子量为26～40kDa的mPEG和NaBH3CN溶液，所述26～40kDa分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算：(1)X＝2～20×m×MWPEG/MWG‑CSF式中：X为不同分子量的mPEG投入总量，m为加入的rhG‑CSF或rhG‑CSFm蛋白含量，MWPEG为mPEG的分子量，MWG‑CSF为rhG‑CSF或rhG‑CSFm的分子量；再按公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量：(2)NaBH3CN加入量＝10×MW还原剂×X/MWPEG式中：MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.5～6.0；再以13～15ml/min的流速，用5～6倍柱体积的pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH 3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液与0.5M～1M氯化钠的混合液，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续150±2分钟，获得三个洗脱峰，即P1，P2和P3，其中P2的峰面积占总峰面积的90±1％，为单修饰的PEG‑rhG‑CSF或PEG‑rhG‑CSFm，即聚乙二醇与rhG‑CSF或rhG‑CSFm蛋白N‑末端单一、定点特异性偶联化合物；其中：上述rhG‑CSF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；rhG‑CSFm为rhG‑CSF‑174或rhG‑CSF‑165，其中rhG‑CSF‑174的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列敲除第2位的Thr获得，rhG‑CSF‑165的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列敲除第2‑11位的ThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuPro获得；上述mPEG指能与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，该mPEG选自mPEG‑ALD或mPEG‑N‑羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG‑琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯或mPEG‑琥珀酰亚胺丙酸酯。