一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法及应用

摘要

本发明公开了一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法及应用。其检测方法：a、新鲜肝脏组织离心制备肝微粒体；b、肝微粒体重悬、匀浆、稀释、离心后取上清得到含可溶性HMG-CoA还原酶源；c、检测HMG-CoA还原酶源的蛋白含量，并稀释至已知浓度；d、将HMG-CoA还原酶源加至已优化的反应体系，检测OD340值并计算酶活性。基于该检测方法建立HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系，计算酶活性抑制率和半数抑制浓度(IC50)，可用于筛选降血脂药物。本发明具有体系优化、安全价廉、批量筛选、结论可信等优点，可有效的筛选HMG-CoA还原酶活性抑制剂，为开发降脂药物提供了简便、快速的方法。

主权项

一种检测HMG‑CoA还原酶活性的改良分光光度法，其步骤是：A、将新鲜肝脏组织以1∶3w/v加入匀浆缓冲液A：100mM蔗糖、50mM KCl、40mMK2HPO4、30mM EDTA，pH 7.2，匀浆，常温下12,000×g离心两次，每次15min，取上清100,000×g离心60min，沉淀用匀浆缓冲液重悬后，100,000×g再次离心60min，沉淀即为肝微粒体；B、将肝微粒体用缓冲液B：缓冲液A加10mM二硫苏糖醇，pH 7.2重悬，再加入等体积含50％v/v甘油的37℃缓冲液B，手动匀浆，37℃温浴60min后，再以缓冲液B稀释3倍，混匀，最后25℃100,000×g离心60min取上清，含有可溶性HMG‑CoA还原酶的肝微粒体蛋白；C、根据蛋白测定试剂盒检测步骤(B)得到肝微粒体的蛋白含量，用缓冲液B稀释蛋白浓度至1mg/ml，得到了蛋白浓度已知的肝微粒体蛋白；D、将步骤(C)得到的肝微粒体蛋白加入优化的反应体系pH 7.0，包括NADPH 100μmol/L、HMG‑CoA 50μmol/L、蛋白浓度为200μg/ml，和缓冲液C：0.2M KCl、0.16M K2HPO4、4mM EDTA和10mM二硫苏糖醇，反应总体积为1ml，先进行37℃预温浴20min，随后加入底物HMG‑CoA以启动酶催化反应，反应时间为60min，用紫外分光光度计检测OD340值的变化，根据以下公式得到HMG‑CoA还原酶活性；酶活性nmol/mg.min＝测定管ΔOD340‑空白对照ΔOD340×1000/6.22×0.2×60。