一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法

摘要

本发明提出了一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。构建RNA干扰载体步骤为：1)插入致死基因ccdB表达单元，改造RNA干扰骨架载体；2)设计一对部分重叠，且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物；3)反向PCR、转化及筛选重组质粒，得到针对目的基因特异性的RNA干扰载体。构建RNA干扰验证载体步骤为：1)插入致死基因ccdB表达单元，改造RNA干扰验证的骨架载体；2)设计一对部分重叠，且含有需验证的靶序列的寡核苷酸引物，3)反向PCR扩增、转化及筛选得到靶序列和报告基因融合的RNA干扰验证质粒。本发明实验周期短、成本低；是一个非常有效地构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。

主权项

一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法，特征在于：1)对RNA干扰载体进行改造，在载体的控制RNA干扰单元表达的启动子与终止信号之间克隆一ccdB基因表达单元，得到表达发夹RNA(shorthairpin，shRNA)的RNA干扰骨架载体；2)引物设计，设计针对目的基因进行RNA干扰的靶序列，根据1)所述的RNA干扰骨架载体的控制RNA干扰单元表达的启动子和终止信号序列，设计一对部分重叠，且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物，此引物应满足以下条件：a)在引物的骨架载体特异性退火的序列5’末端依次加上前述设计的靶序列和发夹环的序列，同时使正反向引物末端带有相互重叠10‑15nt的序列；b)利用该引物扩增得到的产物含有完整的控制基因RNA干扰单元表达的启动子和终止信号序列、针对目的基因的干扰序列和发夹环的序列，同时PCR产物缺失了骨架载体的ccdB基因表达单元；3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干扰骨架载体为模板，进行PCR扩增PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，PCR产物经同源重组自环化，得到表达目的基因特异性的RNA干扰载体。