大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法

摘要

本发明涉及一种大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法；木瓜蛋白酶聚体是在孔径大于0.5μm的载体的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。以表面具有羟基的无机或有机大孔材料为固定化酶载体，经载体表面氨基改性、酶吸附、酶沉淀、同步交联最终实现交联木瓜蛋白酶聚体的形成和与大孔载体共价连接的同步完成。制得的固载化酶载酶量高于普通载体固定化酶；采用共价固定方法避免了应用大孔载体造成的酶泄漏，载体形状可依据实际需要调整，最适催化温度和pH，溶剂及热稳定性均有显著改善。本发明还可应用于其他蛋白酶及脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、果胶酶、氧化酶、L-天冬酰胺酶、天冬氨酸酶、过氧化物酶等。

主权项

一种使用大孔材料为载体“同步法”共价交联‑固载木瓜蛋白酶聚体的方法，其特征是步骤如下：(1)载体表面氨基改性所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，将载体洗净，于90～120℃烘干至质量不再改变；将10～30mL硅烷偶联剂与无水乙醇以1∶1～1∶3比例均匀混合5～30min，然后加入2～10g载体材料，令载体质量与硅烷偶联剂体积比为1∶3～1∶5(g∶mL)，于50～70℃水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体3～4次，放于90～120℃烘箱中干燥过夜至质量不再改变，载体表面氨基含量达到5～15μmol/g；(2)木瓜蛋白酶的吸附用pH为4～10的磷酸缓冲液溶解木瓜蛋白酶，配成浓度为0.05～0.25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1～5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔载体颗粒1～5g，于4～25℃下振摇吸附2～6h；(3)木瓜蛋白酶沉淀吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒1～5g加入到1～10mL沉淀剂中，继续振摇10～30min；(4)“同步法”共价交联向步骤(3)中所得的沉淀体系中加入交联剂至最终浓度为1～5％；混合均匀，于4～25℃下交联2～24h，使沉淀酶聚体在生成CLEAs的同时也与载体孔道表面氨基共价交联，最终实现大孔载体“同步法”共价交联‑固载CLEAs；所得固定化酶用蒸馏水洗涤3～4次，冻干即得大孔载体固载化CLEAs颗粒。