花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法

摘要

本发明公开了花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括：(1)培养基的配制；(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：1)供体植株与花蕾的选择；2)花蕾灭菌；3)花蕾预处理培养；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装；5)小孢子胚状体的培养；6)再生植株的分化与萌发培养；7)再生植株的生根培养与移栽及8)再生植株的倍性检测。本发明显著提高了青花菜小孢子培养的出胚率、出苗率与再生植株的二倍体率，由常规的60个胚/蕾、50％与50％左右分别提高为80个胚/蕾、80％及70％以上，从而可提高花椰菜的育种效率。该方法可在蔬菜育种单位或企业中推广应用。

主权项

花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：(1)培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含重量为：1)花蕾预处理培养基：NLN‑13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L+0.05～0.2％秋水仙碱+1～3％DMSO，pH5.6～6.0，过滤灭菌；2)胚状体诱导培养基：NLN‑13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，pH5.6～6.0，过滤灭菌；3)胚状体分化培养基：B5液体培养基+trans‑ZT 0.5～2mg/L+IAA 0.05～0.2mg/L+BAP 0.5～2mg/L+木糖125～500mg/L+蔗糖或白糖20～30g/L+琼脂糖2～5g/L，pH5.6～6.0，高温灭菌；4)萌发、生根培养基：B5液体培养基+蔗糖或白糖20～30g/L+琼脂6～10g/L，pH5.6～6.0，高温灭菌；(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：1)供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6‑1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；2)花蕾灭菌：用5.2％活性氯次氯酸钠50mL/L+95％酒精100mL/L+吐温20 100μL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在4℃下培养1～5d；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置 于无菌烧杯中，加入10mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按1000rpm离心3分钟，弃上清液；再加10mL胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1.5个花蕾后，再按每4mL培养基中加入0.05mL活性炭混合液混配成小孢子悬浮液，活性炭混合液由NLN‑13液体培养基+琼脂糖2‑5g/L+活性炭1g/L配制，经高温灭菌而成；将该悬浮液分装于直径为6cm或9cm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31‑33℃恒温培养箱中，暗培养24‑72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1‑2周至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养1‑2周，至子叶型胚状体形成；6)再生植株的分化与萌发培养：在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25℃下培养5‑10d至胚状体膨大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；7)再生植株的生根培养与移栽：切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2∶1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；8)再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用partec PA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材料用于育种。