一种T载体介导的测定5′端侧翼未知序列的方法

摘要

本发明是一种涉及限制性内切酶酶切、pUCm-T载体和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列确定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过选用限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm-T载体连接；利用引物设计软件选定T载体上T/A克隆位点上游的一段序列作为5′端引物，选定两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以pUCm-T载体连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。

主权项

一种pUCm‑T载体介导的PCR扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的方法，其特征在于：选用限制性内切酶酶切基因组DNA；纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶补齐和3′端加A，与pUCm‑T连接；利用引物设计软件选定T载体T/A克隆位点上游的一段序列作为5′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以pUCm‑T连接物为模板，用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列；(1)PCR引物的设计：基于已知DNA序列设计两条3′端特异性引物，命名为Primer‑R1和Primer‑R2(18‑22bp)；Primer‑R2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，它比Primer‑R1接近待测的未知序列；针对本发明引入的pUCm‑T载体，在其T/A克隆位点的上游选定一条5′端特异性引物，命名为T‑PrimerF(21bp，Tm值60℃)；(2)限制性内切酶的选择：根据对已知DNA序列上限制性内切酶位点的分析，选用从Primer‑R1到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种内切酶；本发明可供选择的常用的产生5′粘性末端的限制性内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；产生平齐末端的有EcoRⅤ、SnaBⅠ和ScaⅠ等；产生3′粘性末端的有BmtⅠ、PstⅠ、SacⅠ和KpnⅠ等；(3)PCR模板的构建：运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行酶切，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm‑T载体连接，即可作为PCR模板；此步骤若选用的两种内切酶都是5′粘性或平齐末端，只需选用普通Taq酶，否则需要选用带有3′→5′外切酶活性的Ex Taq酶；(4)巢式PCR扩增：以步骤(3)的T载体连接物为模板，采用T‑PrimerF和Primer‑R1为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，采用T‑PrimerF和Primer‑R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。