新型甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种新型甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，该检测方法是采用荧光探针技术，设计一组仅在新型H1N1流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，具体包括以下步骤：(1)参照新型H1N1流感病毒HA基因序列设计特异性引物；(2)取备检样品提取病毒RNA；(3)RT-PCR扩增；(4)质粒标准阳性模板的制备；(5)对收集的荧光曲线进行结果分析。该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性，操作简单快速，能大大缩短检测周期，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。

主权项

一种新型H1N1流感病毒荧光定量RT‑PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)参照新型H1N1流感病毒HA基因序列设计特异性引物；(2)取备检样品提取病毒RNA；(3)RT‑PCR扩增①反转录合成cDNA：反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl Random，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl；37℃作用1h，即反转录完成；②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg2+2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上游引物H1F‑1和下游引物H1R‑1各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用灭菌ddH2O补足；反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃30s，45℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸6min；反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；(4)质粒标准阳性模板的制备①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18‑T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；(5)结果分析，通过ABI7500System SDS Software Version 1.2软件分析收集的荧光曲线判定结果：提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(107～101copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H1F‑2和H1R‑2)各0.6μl，探针0.3μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水7.5μl；反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为1000copies/reaction。