一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其步骤为：胃肠炎病毒总RNA的提取、引物设计、反转录、PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段、猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定、标准品模板得制备、进行荧光定量PCR扩增，得动力学曲线及标准曲线，进行重复性、敏感性及特异性试验。本发明方法呈现出良好的S型扩增曲线，只出现扩增产物特异的单个峰，产物的Tm值均一；检测灵敏度可达3拷贝∕微升，具有很好的敏感性；该方法与其它病毒不发生交叉反应，具有良好的特异性；起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系，反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性。

主权项

一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：所述的检测方法的具体步骤如下：1）采用常规方法提取胃肠炎病毒总RNA；2）引物设计根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列(NC002306)，设计一对特异性引物，目的基因片段为250 bp，引物序列如下： 上游引物P1：5’‑GTATTGGGATTATGCT‑3’下游引物P2：5’‑GGTGGTGGTAGTAGGT‑3’；3）猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT‑PCR扩增取胃肠炎病毒总RNA，加入反转录引物、5×RT Buffer、dNTP、RNasin inhibitor及反转录酶进行反转录得到cDNA；以反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增，得到猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段，取 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化回收PCR产物； 4）猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定将回收纯化后PCR产物与载体连接，将连接产物转化至感受态细胞， 筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基中，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定；5）标准品模板的制备提取验证正确的阳性重组质粒，用紫外分光光度计测定阳性重组质粒的浓度，并计算基因模板拷贝数，将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释，共做7个稀释度：100， 101， 102， 103，104， 105，106，将其作为标准品模板；6）SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测取标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增，得到扩增动力学曲线及标准曲线；选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应，验证此方法的重复性与稳定性；                                               7）敏感性与特异性试验将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释，进行敏感性试验；分别加入猪瘟病毒（HCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）核酸作为阳性对照，同时设置阴性对照，验证此方法的特异性。