作物种子的脂肪酶活性精确定量检测方法

摘要

本发明属于一种作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，是取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液浸提得到酶提取液；配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；以tween-20和橄榄油组成的底物乳化液；取酶提取液加入底物乳化液，在35-37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷混匀，移取有机相，加入显色剂，最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低。通过制定脂肪酸标准曲线，将测得的吸光度和反应体系中脂肪酸浓度的变化对应起来，并通过自定义酶活力单位，将不同样品的脂肪酶活力完全量化。该方法用于精确定量时灵敏度高，稳定性好，重现性好，分辨率高。

主权项

作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其特征在于具体步骤如下：(1)、取水稻、玉米、油菜、花生或大豆作物种子的种子胚或者种胚和糊粉层放入研钵中，加入pH7.5Tris‑HCl缓冲液，充分研磨后，浸提30分钟，获得酶提取液；(2)、称取5g乙酸铜，溶解于100毫升蒸馏水中，再加入3毫升吡啶，得脂肪酸显色剂；(3)、将tween‑20和橄榄油按1∶1重量比混合，经高速震荡均质化，得底物乳化液；(4)、取1毫升酶提取液于大试管内，再加入5毫升步骤(3)所得到的底物乳化液，37℃水浴震荡20小时，反应完毕后，加入7毫升异辛烷，充分震荡1分钟，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相5毫升，在该移取上层有机相中加入1毫升显色剂，充分震荡混匀5分钟；最后，8500rpm离心15分钟，取上清液于710nm比色；酶活性管中清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酸活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液4毫升于7毫升离心管中，加1毫升脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度作图，正辛酸浓度单位mg/毫升，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，在上述反应条件下，将每毫升反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。