乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途

摘要

本发明涉及一种乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途。本发明利用牛初乳中的乳铁蛋白和酶制剂，通过酶法水解，制备得到乳铁蛋白抗菌肽酶解物，再将上述酶解物经大孔吸附静态或动态脱盐、凝胶过滤色谱、半制备高效液相色谱和分析型高效液相色谱分离纯化后得到纯的乳铁蛋白抗菌肽产品，该产品具有高效和广谱的抗菌能力，因此在食品、饲料、医药领域中具有很广阔的应用前景。

主权项

一种乳铁蛋白抗菌肽的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：(i)酶解步骤：在酶反应器中制备浓度50mg/mL乳铁蛋白去离子水溶液，该溶液在40℃预处理20min，再用1.0mol/L HCl将其溶液的pH调节到2.5，以乳铁蛋白重量计加入0.5％Sigma公司生产的EC3.4.23.1胃蛋白酶，然后控制反应体系的pH值恒定，在这个温度下进行酶解，采用TNBS法测定水解度，直到水解度达到11％，反应结束后，在85‑100℃灭酶5‑10min，用碱将其反应介质的pH调节到6.8‑7.2，再在7000‑15000r/min下冷冻离心10‑30min，得到含有10‑50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液；(ii)静态脱盐步骤：往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是1∶1‑2∶1，在温度15‑30℃下以150‑200r/min振荡6‑12h，然后分离上清液，该树脂用去离子水洗涤，至电导率小于15μs/cm，再用70‑85％乙醇水溶液洗脱；(iii)蒸发浓缩步骤：步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在50‑65℃进行旋转蒸发浓缩到100‑300mg/mL，再进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物‑1；(iv)凝胶过滤色谱分离步骤：将步骤(iii)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物‑1制备成10‑50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，上样流速为2‑3mL/min，再用去离子水以洗脱流速12‑25mL/h洗脱，得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物‑2；(v)半制备高效液相色谱分离步骤：将步骤(iv)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物‑2制备成10‑50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，使用半制备反相高效液相色谱柱，以流速2‑3mL/min进行半制备高效液相色谱分离，得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物‑3；(vi)分析型高效液相色谱分离步骤：将步骤(v)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物‑3制备成10‑50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶的去离子水溶液，使用分析型高效液相色谱柱，以流速0.7‑1.5mL/min进行分析型高效液相色谱分离， 分离得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到所述的乳铁蛋白抗菌肽。