一种自动快速鉴定蛋白磷酸化位点的方法

摘要

本发明涉及蛋白磷酸化位点的检测和鉴定，特别是一种自动快速鉴定蛋白磷酸化位点的数据处理方法，其通过纳喷毛细管液相色谱-多级串联质谱高通量鉴定生物样品中蛋白磷酸化位点。该方法根据磷酸化肽段离子在质谱中容易丢失磷酸形成特征性的中性丢失碎片离子，进而可以利用多级质谱对碎片离子进行三级谱分析的原理，结合假阳性率评估，利用MS3与其对应的二级谱数据库搜索结果的匹配，通过门槛值的设定方便的实现特定可信度下的蛋白磷酸化位点的鉴定。与目前常用的手工校正的方法相比，本发明的优点是无需手工校正，简单，快速的得到高可信度磷酸化肽段的鉴定结果，适合于大通量分析和大规模鉴定。

主权项

一种蛋白磷酸化位点鉴定方法，其特征在于：1)以蛋白酶解液为上样样品，磷酸肽混合物经毛细管反相液相色谱‑质谱联用分析，利用纳米电喷雾离子源直接进入质谱进行分析；质谱采用数据依赖扫描模式，中性丢失核质比设为98，49，32.7，质谱的扫描范围为M/z400‑2000；获得色谱和质谱谱图数据；2)A.谱图筛选及磷酸肽的数据库搜索：首先利用MS2和MS3的母离子的m/z的差值，确定离子所带的电荷数，进而去除价态不符的谱图；然后根据蛋白样品的来源选择对应的数据库搜索，对质谱的每一个MS2和MS3谱图数据分别进行匹配，得到样品氨基酸序列信息；或者B.磷酸肽的数据库搜索及氨基酸序列信息筛选：首先根据蛋白样品的来源选择对应的数据库搜索，对质谱的每一个MS2和MS3谱图数据分别进行匹配，得到样品氨基酸序列信息；然后利用MS2和MS3的母离子的m/z的差值，确定离子所带的电荷数，进而去除价态不符的氨基酸序列；3)将MS3以及其对应的MS2匹配得到的样品氨基酸序列信息进行比较，选择同时出现的样品氨基酸序列信息；并且从中选择一个相互加和打分最高的MS3以及其对应的MS2匹配得到的样品氨基酸序列信息；获得一系列的样品氨基酸序列信息；所述MS2为通过调节门槛值主动匹配肽段的二级谱图；所述MS3为由其丢失磷酸(98Da)所形成的特征中性丢失离子得到的三级谱图；4)根据所获得的一系列样品氨基酸序列信息中反映的假阳性率依次提高数据筛选的门槛值，得到假阳性率≤10％的氨基酸序列信息，假阳性率采用反向数据库检索的方式确定，根据氨基酸序列信息即可确定蛋白的磷酸化位点。