主权项 |
一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法,依次经过贝类DNA提取,限制性内切酶消化DNA,对酶切后的DNA进行接头连接,PCR预扩增和选择性扩增,产物检测及图像和数据的采集和分析,其特征在于所述的PCR预扩增和选择性扩增包括如下步骤:a、DNA片段的预扩增:取5μL连接完成的DNA样品,加入:50ng/μL的Mse I引物1.5μL,50ng/μL的EcoR I引物1.5μL,10×PCR Buffer 5.0μL,5U/μL的Taq酶0.2μL,2.5mM d NTP 4.0μL,加水至50μL,混匀后,在如下PCR条件扩增:94℃预变性2min,94℃变性30S,56℃退火30S,72℃延伸60S,20个循环,引物带有一个碱基,为M00+C,预扩增完成后,在1%琼脂糖胶中检测预扩增的效果;预扩增引物为:E01:5′‑GACTGCGTACCAATTCA‑3′;M02:5′‑GATGAGTCCTGAGTAAC‑3′;b、AFLP的选择性扩增:荧光引物是在EcoR I引物的5′端加了荧光标记,用多对引物组合对各个体进行了选择性扩增,取5μL稀释的预扩增混合液,加入:50ng/μL的EcoR I引物1μL,50ng/μL的Mse I引物1μL,2.5mM dNTP 1.6μL,5U/μL的Taq酶0.2μL,10×PCR Buffer 2.0μL,加H2O至20μL,PCR扩增:94℃预变性2min,94℃变性30S,65℃退火30S,72℃延伸60S,进行12个循环,每个循环退火温度降低0.7℃,至56℃;94℃变性30S,56℃退火30S,72℃延伸60S,进行8个循环,扩增完成后,取5μL在1%琼脂糖胶中检测扩增效果,扩增后的样品中加入15μL变性Buffer,混合,95℃变性5min后,立刻冷却到4℃。 |