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一种富集棉花磷酸化蛋白质的方法，其特征在于：1)溶液配制(1)0.5mol/L pH7.54‑羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes缓冲液：0.5mol Hepes溶解于800mL双蒸水，NaOH调节pH到7.5，定容到1L；(2)0.5mol/L pH6.12‑N‑吗啉乙磺酸MES缓冲液：0.5mol MES溶解于800mL双蒸水，NaOH调节pH到6.1，定容到1L；(3)提取缓冲液：含50mmol/L pH为7.5Hepes缓冲液，质量体积百分比40％蔗糖，60mmol/L氟化钠NaF，体积百分比浓度为2％的β‑巯基乙醇，1mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF，质量体积比2％聚乙烯吡咯烷酮PVP，质量体积百分比浓度为2％的十二烷基磺酸钠SDS。混合、双蒸水溶解、定容；(4)孵育缓冲液IB：含30mmol/L pH6.1的MES缓冲液，100mmol/L谷氨酸钠，100mmol/L天冬氨酸钾，质量体积百分比0.25％3‑[(3‑胆酰胺丙基)‑二乙胺]‑丙磺酸CHAPS和8mol/L尿素。混合、双蒸水溶解、定容；(5)洗涤缓冲液WB为：含30mmol/L pH6.1的MES缓冲液，150mmol/L谷氨酸钠，150mmol/L天冬氨酸钾，质量体积百分比0.25％CHAPS和8mol/L尿素。混合、双蒸水溶解、定容；(6)洗脱液EB为：200mmol/L焦磷酸钾，8mol/L尿素，调节溶液pH到9.0；(7)质量体积百分比浓度为100％三氯乙酸TCA：直接向500g TCA中加入237mL双蒸水，溶解后即为100％TCA。2)棉花总蛋白的提取取1g新鲜的棉花胚珠或叶片，加入等量的交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP和等量的石英砂，在液氮中研磨至粉末，加入10mL含体积百分比1％的β‑巯基乙醇的冰丙酮，充分颠倒混匀50次；10,000g离心20min后，沉淀加入2mL提取缓冲液，6mL pH为8.0的Tris饱和酚，混匀，4℃静置30min；4℃，10,000g离心10min，收集酚相，加入5倍体积的冰丙酮，‑20℃过夜后，15,000g离心10min，沉淀悬浮于5mL冷甲醇，冷甲醇洗涤两次，再用5mL体积百分比浓度为80％的冰丙酮洗涤一次，4℃真空干燥，得到总蛋白，‑70℃密封保存备用。3)利用Al(OH)3亲和层析法MOAC富集棉花磷酸化蛋白质(1)取7mg总蛋白溶解于12mL孵育缓冲液IB，10℃孵育过夜；(2)超声波破碎处理，促进蛋白质溶解：功率100W，3s脉冲激发，共破碎3min；(3)12,000g离心6min，上清液即为总蛋白质的水溶液，保存于冰水中；(4)基质的平衡：称取1400mg Al(OH)3，加入7mL IB，涡旋5次，每次2min，常温孵育30min，5,000g离心5min，弃上清，沉淀再重复平衡两次；(5)将总蛋白的水溶液加入经过IB平衡的Al(OH)3基质中，10℃涡旋60min，使磷酸化蛋白质充分吸附到基质中；(6)12,000g离心6min，去上清，基质用10mL IB洗涤3次，然后再用10mL洗涤缓冲液WB洗涤1次；(7)最后用20mL洗脱液EB，分两次，每次10mL洗涤基质，将结合到基质上的磷酸化蛋白质洗脱下来，收集洗出液，合并两次洗脱的洗出液；(8)向洗出液中加入0.01倍体积的质量体积百分比2％脱氧胆酸钠DOC，涡旋1min，再加入0.1倍体积的质量体积比100％TCA，混匀后放于冰上1h，沉淀磷酸化蛋白质；(9)14,000g离心10min，沉淀用质量体积比25％TCA洗涤一次，离心后，沉淀悬浮于5mL含有10mmol/L pH7.5Tris‑HCl的体积百分比80％冰丙酮中，涡旋，14,000g离心10min；(10)用5mL冰丙酮洗涤沉淀，15,000g离心15min，沉淀真空干燥，即得到纯化的磷酸化蛋白质干粉，‑70℃密封保存。 |
