一种流感病毒疫苗的生产方法

摘要

本发明公开了一种禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：(1)制苗用细胞的传代与培养；(2)细胞毒种的繁殖；(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；(4)制苗毒液的繁殖；(5)病毒液的收获。本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，不会受制于原料供应，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定，显著提高疫苗产量和质量。

主权项

一种流感病毒疫苗的生产方法，其特征在于：选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附生长的载体；选择MDCK细胞作为制苗用细胞；并包括如下步骤：(1)制苗用细胞的传代与培养：取细胞培养瓶中生长良好的MDCK细胞，经EDTA‑胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37℃，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；(2)细胞毒种的繁殖：用病毒培养液，将流感种毒稀释接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，培养温度为37℃，至细胞50‑100％病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒.(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤(1)中已形成良好单层的细胞培养瓶上生长良好的MDCK细胞，经EDTA‑胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×104/ml～5×105/ml的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37℃、PH6.8‑7.6、溶氧30％‑60％、搅拌速度30‑60rpm，进行反应器自动控制、微载体悬浮培养；(4)制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5×105/ml～5×106/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤(2)中之生产种毒，设定培养温度37℃、PH6.8‑7.6、溶氧30％‑60％、搅拌速度30‑60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病交情况，待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液；(5)病毒液的收获：将上述步骤(4)获得的上清液经离心或过滤去除细胞碎片，即制得病毒液。