猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒双重检测方法

摘要

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法，属于生物技术领域。分别设计了针对PRRSV和BVDV的一对基因特异性引物，建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR检测方法，对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4ng和7×10-4ng，用该方法对江苏省75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行检测，结果PRRSV阳性55份，BVDV阳性14份，其中PRRSV和BVDV混合感染12份，PRRSV和BVDV与单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3％和92％，证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。同单一检测方法相比，双重PCR检测方法能够节省实验时间和成本，提高检测的效率。

主权项

猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV和猪源牛病毒性腹泻病毒BVDV双重RT‑PCR检测方法，其特征在于：(1)引物设计针对PRRSV核衣壳蛋白N蛋白基因和BVDV 5′非编码区设计和合成两对基因特异性引物：BVDV B1：5′‑GCCATGCCCTTAGTACGACTAGC‑3′，B2：5′‑CATCTCCATGTGCCATGTACA GC‑3′，扩增片段大小为290bp；PRRSV N1：5′‑CCA GAATTCCATGCTGAGG，N2：5′‑CGAGGATCCAATATGCCAAATAACAACGG‑3′，扩增片段大小为374bp；(2)含有PRRSV和BVDV总RNA提取和cDNA合成提取含有病毒PRRSV和BVDV感染细胞的总RNA，然后应用Oligo dT进行反转录，获得针对PRRSV和BVDV的cDNA；(3)PCR扩增二重PCR扩增体系为：模板2.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mM Mg2+ 1.5μL，2.5mMdNTPs 2.0μL，上下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，双蒸水补充总体积至25.0μL；在二重PCR反应体系中同时出现了374bp和290bp两条目的条带，则表明猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV和猪源牛病毒性腹泻病毒BVDV同时存在。