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Un procedimiento para cuantificar metabolitos de la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos, sin necesidad de purificación previa de los metabolitos de la vitamina D, que comprende las siguientes etapas: (a) adición de una cantidad apropiada de una serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica a una muestra que contiene plasma o suero sanguíneos y la digestión de las proteínas de unión a vitamina D en el plasma o suero sanguíneos, hasta que ya no puedan unir más metabolitos de la vitamina D; (b) dilución de dicha muestra que contiene la serina proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (c) proporción de una composición trazadora de la vitamina D, que está acoplada a una fase sólida; (d) proporción de un anticuerpo monoclonal contra los metabolitos pertinentes de la vitamina D; (e) combinación de la muestra con los metabolitos de la vitamina D, la fase sólida con la composición trazadora de la vitamina D y el anticuerpo monoclonal, y la realización durante un periodo de tiempo predeterminado de una reacción de unión competitiva entre los metabolitos de la vitamina D, el trazador de la vitamina D unido a una fase sólida y el anticuerpo monoclonal en un tampón de unión en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (f) separación de la fase sólida con el compuesto trazador de la vitamina D y del anticuerpo monoclonal unido del tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase sólida; y (g) determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal sobre la fase sólida, y cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en el plasma o suero sanguíneos por correlación con muestras patrón.
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