富集和纯化糖基化蛋白的方法

摘要

一种富集和纯化糖基化蛋白的方法，其凝集素的固定化是将环氧乙基衍生化的磁粒加入离心管中，经固定化反应、清洗、封闭、重复清洗，凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒，加入保存缓冲液保存。其糖基化蛋白的分离纯化是将制备好的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒经结合，加入标准糖基化蛋白充分偶联，再经多次清洗后，洗脱，得富集纯化的糖基化蛋白，装入透析袋中脱盐。本发明解决了背景技术中用亲和层析柱对糖基化蛋白分离富集方法复杂、回收率较低及价格昂贵的技术问题。本发明实现方法简便，回收率较高，分离富集糖基化蛋白的亲和层析柱成本低，使用便利。

主权项

一种富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤1)凝集素的固定化(1)环氧乙基衍生化磁粒的预制：将环氧乙基衍生化的磁粒加入离心管中，标为1号离心管；再加入偶联缓冲液，摇匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；所述的偶联缓冲液为pH8.30.1M的NaHCO30.5M的NaCl缓冲液；(2)固定化反应：取凝集素溶液，加于1号离心管中，摇匀；置于空气振荡器中，摄氏35～40℃反应40～90分钟；反应完毕，在磁性分离器上分离、弃上清液；则，1号离心管中的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上；(3)清洗：向1号离心管中加入清洗缓冲液，摇匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；(4)封闭：向1号离心管中加入封闭液，摇匀，置于空气振荡器中，摄氏35～40℃反应1～2小时；反应完毕，在磁性分离器上分离、弃上清液；所述的封闭液为加入1mg/ml的脱脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液；(5)清洗：在1号离心管中加入清洗缓冲液，混匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；重复清洗3次；所述的清洗缓冲液为0.5％的含吐温-201×磷酸盐、或碳酸盐缓冲液；(6)保存：加入保存缓冲液，于摄氏2～6℃保存；所述的保存缓冲液为0.5％的含吐温-201×磷酸盐、或碳酸盐缓冲液；2)糖基化蛋白的分离纯化(1)预制：取制备好的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒，加入4号离心管，在磁性分离器上分离、弃上清液；(2)结合：向4号离心管中加入结合缓冲液，再加入标准糖基化蛋白，然后再加入超纯水，置于摇床上，在室温下摇动4～6小时；将4号离心管，在磁性分离器上分离、弃上清液；所述的结合缓冲液为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mMTris-HCl pH7.0的缓冲液；(3)清洗：向4号离心管中加入清洗缓冲液1，置于摇床上，摇动1～3分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；再重复清洗一次；所述的清洗缓冲液1为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 7.0的缓冲液；(4)清洗：向4号离心管中加入清洗缓冲液2，清洗1～3分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；再重复清洗二次；所述的清洗缓冲液2为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 7.0的缓冲液；(5)洗脱：向4号离心管中加入清洗缓冲液3，摄氏20～30℃清洗20～40分钟，在磁性分离器上分离，取上清液移入5号离心管中，即得富集纯化的糖基化蛋白；所述的清洗缓冲液3为1mM CaCl2、1mMMnCl2、1mMKCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl pH 7.0的缓冲液；(6)脱盐：将富集纯化的糖基化蛋白装入透析袋中，用水于摄氏2～6℃透析1.5～2.5小时后换水，重复透析三次，脱去清洗缓冲液3。