黄芩苷单克隆抗体及其制备方法与应用

摘要

黄芩苷单克隆抗体及其制备方法与应用，涉及一种黄芩苷单克隆抗体。提供一种黄芩苷单克隆抗体(BCL-MAb)及其制备方法与应用。所述黄芩苷单克隆抗体是一种能与黄芩苷分子发生免疫反应的特异性蛋白质。免疫抗原的合成及其鉴定；动物免疫；细胞融合及阳性克隆筛选；BCL-MAb性质鉴定。利用该抗体与黄芩苷的高度特异性反应建立黄芩苷的酶联免疫法，并应用于黄芩药材及其中成药内黄芩苷的定性和定量检测。经过优化了的ELISA检测法操作简便、反应快速，能同时测定大量样品，大大提高测定黄芩苷含量的工作效率，在黄芩中成药生产的质量控制、植化、药学和药理等研究工作中具有较广的实际用途。

主权项

黄芩苷单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)免疫抗原的合成及其鉴定通过碳二亚胺法将黄芩苷与载体蛋白偶联成免疫抗原，经过基质辅助激光解吸附电离-时间飞行质谱进行质谱鉴定半抗原数，以确定合成结果是否适于后续的动物免疫；2)动物免疫选用6～8周龄的雌性BALB/C小鼠，首次免疫采用BCL-HSA与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后皮下多点注射，剂量为100μg/只；两周后采用BCL-HSA与等体积的弗氏不完全佐剂进行第1次加强免疫，以后每隔两周加强免疫一次，4次加强免疫后10d，眼球取血用间接ELISA法测定小鼠血清效价，在第4次加强免疫后用间接ELISA测小鼠血清效价，效价在1∶8000以上时进行冲击免疫，准备融合；3)细胞融合及阳性克隆筛选直接用BCL-HAS的PBS溶液进行脾脏冲击免疫，取出脾脏经预处理后进行细胞融合，采用间接ELISA法进行初步筛选，筛选时设立HSA包被酶标板进行同步检测，阳性孔细胞经有限稀释克隆化和扩大培养；4)BCL-MAb性质鉴定用棋盘滴定法确定最佳的包被浓度以及单抗稀释度，测定腹水和培养液上清的效价；应用间接竞争ELISA法，测定BCL-MAb的相对亲和力、半抑制率及其竞争抑制率，制备标准曲线；选择与黄芩苷结构相似的黄芩素、大豆苷元、芦丁、熊果酸，应用间接竞争ELISA法测定各竞争物的IC50，并按照下列公式计算其交叉反应率；CR(％)＝IC50(BCL)/IC50(X)×100。