一种抗虫转基因油菜的培育方法

摘要

本发明公开了一种广谱抗虫转基因油菜的培育方法，其步骤：A、目标基因序列的获得；B、反义RNA表达载体的构建；C、遗传转化；D、转基因植株检测；E、抗虫性鉴定；F、抗虫性品种培育。本发明阻断了植物内源芥子酶基因的翻译，消除了或降低了芥子酶的合成及其活性，使植物体内的完整硫苷无法被降解，无法形成专性害虫能识别的挥发性化学信号物质，从而消除了专性害虫对作物的识别信号，避免了害虫危害，或者即使取食，也抑制其产卵和繁殖，从而有效控制害虫。本发明效果持久、范围广、成本低和无公害。

主权项

一种抗虫转基因油菜的培育方法，包括下列步骤：A、目标基因序列的获得：根据NCBI基因登录号为NM_180746的拟南芥芥子酶基因TGG1从第38至410个碱基的序列信息，针对DNA保守编码区，设计特异性PCR引物：P1：5’-GCGCCCGGGATGAAGCTTCTTATGCTCGCCT-3’           XmaIP2：5’-CGCACGCGTCTTTTGGAAGGAGTCTTGACCAC-3’           MluI                            ，提取拟南芥生态型Columbia幼苗叶片的RNA，反转录为双链DNA作为PCR扩增的模版，扩增获得供基因工程操作的芥子酶基因片段；根据NCBI基因登录号为NM_180745的拟南芥芥子酶基因TGG2从第4至393个碱基的序列信息，针对DNA保守编码区，设计特异性PCR引物：P3：5’-GCGACGCGTATGCAACACAACACATACATCTAC-3’           MluIP4：5’-CGCGGATCCCCACGCAAAGGAGAATCTGT-3’           BamHI                           ，提取拟南芥生态型Columbia幼苗叶片的RNA，反转录为双链DNA作为PCR扩增的模版，扩增获得供基因工程操作的芥子酶基因片段；B、反义RNA表达载体的构建：将A步骤扩增获得的拟南芥芥子酶基因TGG1的片段的3’末端与A步骤扩增获得的拟南芥芥子酶基因TGG2的片段的5’末端连接为一个更长的片段，反向插入pBI121载体质粒的多克隆位点，并置于CaMV 35S启动子的控制之下，即得；C、遗传转化：将步骤B构建的反义RNA表达载体通过农杆菌EHA105介导的遗传转化方法导入到植物组织中，进一步将组织培养为植株；D、转基因植株检测：利用PCR或分子杂交鉴定阳性转基因植株，将其隔离种植，单株收获；E、抗虫性鉴定：种植步骤D获得的转基因植株，田间自然鉴定抗虫性或取回叶片在室内进行抗虫性鉴定，选择抗虫性显著提高的单株并自交留种；F、抗虫性品种培育：种植步骤E收获的种子，继续进行抗虫性鉴定，纯合单株培育为品系或育种材料。