用于RNA体外扩增的试剂及方法

摘要

本发明公开了用于RNA体外扩增的试剂及方法，包括连接物、引物、启动子和限制性内切酶等，达到了体外扩增RNA的目的。本发明中目标RNA经过与连接物连接，在引物存在下进行RT-PCR后得到扩增，再使用了茎环的结构形成了限制性内切酶的唯一位点，酶切所得产物在启动子启动下经过转录后可以得到除了5’端多一个G和少数3’端多一个A或C外与目标RNA样本完全一样的序列，所得的RNA产物与原样本RNA一样可以直接使用。本发明可以应用到各种与核糖核酸应用等相关的方面包括一般性科研、医疗检测和法医鉴定。

主权项

1.一种用于RNA体外扩增的试剂，其特征在于：由以下组份组成：以下N与Nc为互补碱基，d，e，f，h，k，m≥0，g，j，q≥1，b，i，n≥2的整数；A.连接物SL1：连接物SL1为3′脱氧或被封闭，5’磷酸化的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通式为5’P-(N)_b(N)_d-3′，其中(N)_b为限制性内切酶的识别序列和酶切位点；或连接物SL1为具有Stem-loop结构的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通式为5’P-(N)_b(N)_eN(N)_fN N(N)_gN Nc(Nc)_fNc-3′，其中(N)_b为使用的限制性内切酶的识别序列和酶切位点，N(N)_gN为Stem-Loop结构中Loop的碱基序列；B.线性连接物LL1：为含有启动子相关序列的RNA或DNA或DNA-RNA杂合链，其通式为5′-(N)_h(NNN......NNN)-3′，其中，(NNN......NNN)为所用启动子的相关序列；C.引物SLP1：是以SL1为基础设计的用于RT和PCR的DNA序列，其3’端含有限制性内切酶的识别序列和内切酶位点，其5’端是游离的羟基或被磷酸化或连接有生物素；D.线性引物LLP1：是以LL1为基础设计的用于PCR的DNA序列，其5’端是游离的羟基或被磷酸化或连接有生物素；E.连接物SL2为茎环结构，当切割点在5’端的时，连接物SL2的3’粘性端部分或全部与SLP1序列一致，其通式为其中为形成环的碱基序列，(N)_i和(Nc)_i为形成环后互配的部分，5’磷酸化或不磷酸化；或连接物SL2为茎环结构，当切割点在3’端的时，连接物SL2的5’粘性端部分或全部与SLP1序列互补，其通式为其中为形成环的碱基序列，(N)_n和(Nc)_n为形成环后互配的部分，所述cSLP1是SLP1的互补碱基序列；或当已知序列的单个RNA样本中没有所用的内切酶识别序列和切割位点时，所述连接物SL2是线性结构，其碱基组成是或包含引物SLP1或互补于引物SLP1；F.限制性内切酶；G.启动子和相应的RNA聚合酶。