利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法

摘要

本发明涉及一种利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法，该方法包括新疆紫草外植体的选择和处理、发根农杆菌的活化培养、子叶外植体的感染和毛状根的诱导、无菌新疆紫草毛状根根系的获得及新疆紫草毛状根的液体培养及紫草素等步骤。由于所使用的毛状根具备在无外源激素培养基上快速、自主生长的特性，因此该方法不仅能克服利用细胞培养物生产紫草素时细胞培养物生长缓慢、需外加激素维持其生长的不足，而且具有紫草素产出率稳定、培养时操作简便、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点。尤其为利用毛状根培养法生产紫草素提供了一种稳定、可持续的新型药源，为今后应用生物反应器进行紫草素规模化生产提供了可靠的来源和物质基础。

主权项

一种利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法，其特征在于按下列步骤进行：新疆紫草毛状根的诱导：a、将新疆紫草种子用75％酒精消毒30s-60s，再用0.1％升汞表面消毒5-10min，无菌水充分漂洗后过夜，再用抗生素头孢噻肟钠浸泡60min，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境培养15-20d，得到无菌苗，切取无菌苗幼嫩子叶，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境中1/2MS固体培养基预培养2d，待用；b、将发根农杆菌按常规方法接于YEB固体培养基上，黑暗培养2d后，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，温度28℃，转速160-180r/min，振荡培养过夜，所得菌液置于温度4℃，转速5000r/min的离心机中离心5-10min，所得菌体再用MS液体培养基重悬后用于感染；c、将子叶外植体置于步骤b的发根农杆菌菌液中，浸泡5-15min，取出，于1/2MS固体培养基中共培养2d后，转接在含头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗培养形成毛状根；d、将步骤c的毛状根剪取2-3cm，转入含头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基上，进行单根离体培养，每7d继代一次，逐渐降低抗生素浓度，直至无菌为止，再采用PCR、rolC基因序列分析和Southern分子杂交对毛状根进行遗传转化鉴定，确定毛状根株系；新疆紫草毛状根的生长e、将步骤d毛状根接种于无铵的MS或SH或1/2MS液体培养基中，加入0.5-1g/L酸水解酪蛋白，肌醇1g/L，15-30g/L的蔗糖，pH值5.6-6.0，温度25±1℃，转速为100-120r/min的条件下进行振荡、黑暗培养12-15d；新疆紫草毛状根生产紫草素f、将步骤e生长的毛状根接种于含酸水解酪蛋白0.5-1g/L和蔗糖15-30g/L的M-9液体培养基中培养5-15d，添加大孔吸附树脂NKA-9 1g/瓶，pH值为5.6-6.0，温度25±1℃，转速100-120rpm的条件下进行培养，25-30d为一个培养周期，取出毛状根，温度50℃烘干，研磨成粉，用浓度95％乙醇浸提3次，合并提取液，浓缩，即可得到紫草膏。