主权项 |
一种从纤细席藻中提取藻蓝蛋白的方法,其特征在于包括如下步骤:A、培养液的配制:按每升水加入硝酸钠0.8~2.5g、磷酸氢二钾0.02~0.05g、硫酸镁0.06~0.09g、氯化钙0.02~0.05g、柠檬酸0.004~0.008g、柠檬酸铁铵0.004~0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001~0.003g、碳酸钠0.01~0.04g,微量元素溶液0.5~2ml,其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270~300mg、四水氯化锰170~200mg、七水硫酸锌18~25mg、二水钼酸钠15~30mg、五水硫酸铜6~10mg,完全溶解后搅匀制得培养液;B、纤细席藻的培养:首先是一级培养,由纤细席藻种接入培养液中静止培养或通气培养时,调节气流在1.5~3.5L.min-1,光强控制在65~85μE.m-2.s-1,温度控制在22~35℃,当培养5~10天后,转入到二级培养;其次是二级培养,将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养,调节气流在2.5~5L.min-1,无菌处理,光强控制在75~95μE.m-2.s-1,温度控制在22~35℃,培养5~10天后转入到三级培养;第三是三级培养,将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养,调节气流在3~6L.min-1,无菌处理,光强控制在70~100μE.m-2.s-1,温度控制在22~35℃,培养5~10天后作为继续培养的接种种源;第四是继续培养,首先是小循环培养池培养,将三级培养后所得的藻种接入小循环培养池,控制温度在22~35℃,利用自然光进行光照,控制光照强度在120~180μE.m-2.s-1,搅动培养基;其次是大循环培养池培养,将小循环培养池中培养4~7天后的纤细席藻转接到大循环培养池中,将大循环培养池中培养10~20天后的纤细席藻过滤收得纤细席藻藻浆;C、纤细席藻粉的制备:将藻浆经过离心获得纤细席藻藻泥,将纤细席藻藻泥经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到纤细席藻粉;D、纤细席藻藻蓝蛋白的抽提:向纤细席藻粉中加入7~10倍重量的0.05~0.1mol.L-1,pH值为6.0~8.0的磷酸缓冲溶液,充分搅匀后置于-10~-20℃下冰冻,待冻结后取出,置于20~30℃下融溶,待其完全融溶后,再将其冰冻,如此反复冻融3~5次,然后再3000~6000rpm下离心10~15min,收集上清液,即为藻蓝蛋白粗提液;E、纯化:在冰浴条件下,在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为50~70%的硫酸铵避光盐析20~40min,然后在3~5℃下3000~6000rpm离心15~25min,弃除上清液,用一倍体积的0.05~0.1mol.L-1,pH值为6.0~8.0的磷酸缓冲液溶解沉淀物,避光透析20~30h后离心,取上清液用0.05~0.1mol.L-1,pH值为6.0~8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-52离子交换柱,并用0.05~0.1mol.L-1,pH值为6.0~8.0的磷酸缓冲液和0.1~0.3mol.L-1的NaCl溶液洗脱,用收集蓝色组分,冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。 |