一种组织工程化脂肪组织的构建方法与应用

摘要

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自脂肪组织的干细胞在体外分别向脂肪和向内皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞与生物材料相结合，共同构建组织工程脂肪组织的方法，利用此方法可制备用于弥补软组织缺陷、创伤组织修复以及正常组织的填充塑型物。应用本方法构建的脂肪组织，不仅可以用于一些组织的填充、修复还可以用于乳腺的重建、增大、矫正和美容。例如，头面部与颈部肿瘤的切除、各种复合型创伤、先天性畸形的填充修复以及脸颊、嘴唇等部位的美容和皱纹去除。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。

主权项

一种组织工程化脂肪组织的构建方法，其特征在于：由向脂肪细胞和向血管内皮细胞诱导分化的细胞与生物材料共同构建而成；所述的向脂肪细胞诱导分化的细胞和向血管内皮细胞诱导分化的细胞是从脂肪组织分离的干细胞经体外诱导分化而获得；所述的生物材料是指生物降解型高分子材料，为选自胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA和PLA中的一种；脂肪组织来源的干细胞的分离、干细胞的体外诱导分化以及与生物材料的共培养包括以下步骤：(1)脂肪组织来源的干细胞的分离培养：1)以磷酸缓冲液冲洗脂肪组织后，加入缓冲液，搅拌并放置至澄清，除去损伤组织、血液和红细胞；2)蛋白水解酶水解脂肪组织；3)平衡密度离心，分离脂肪组织来源的干细胞；4)磷酸缓冲液重悬分离的细胞，加入高张盐溶液保温及加入红细胞裂解液，破坏并除去残留的红细胞；5)离心去除上清液，加入磷酸缓冲液重悬及离心洗涤，得到的脂肪组织来源的干细胞，用含5％～15％血清的DMEM或者D/F12细胞培养基进行扩大培养，以增加干细胞的数量；(2)脂肪组织来源的于细胞向血管内皮细胞诱导分化：1)取扩增的第3～8代脂肪组织来源的干细胞以培养基调整成浓度为1～2×105/ml的细胞悬液，轻轻滴加在可降解的、一定体积的生物活性支架材料上；2)将细胞材料复合体放入负压容器中，负压处理，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面；3)加入含5～15％血清的DMEM培养基继续培养20小时；4)将细胞材料复合体放入血管内皮细胞诱导的培养基中，共同培养12～21天；(3)脂肪组织来源的干细胞向脂肪细胞诱导分化：1)在将脂肪来源的干细胞向血管内皮细胞分化的同时，将第3～8代大规模生产的脂肪来源的干细胞放入培养瓶中，以脂肪细胞诱导分化的培养基进行诱导培养；2)细胞在显微镜下观察有脂质小泡存在，经判定向成熟脂肪细胞分化的趋势后，将细胞消化处理，以普通培养基重悬制成细胞悬液，备用；(4)含有诱导的血管内皮细胞和脂肪细胞的工程化脂肪组织的构建：1)在脂肪组织来源的干细胞向成血管诱导分化12～21天后，将已向脂肪细胞分化的细胞悬液滴加种植在有血管内皮样细胞的支持材料的另一面，然后将细胞材料复合体放入孵箱中，37℃，5％CO2，饱和湿度下孵育1～2小时，使细胞粘附到材料上面；2)向细胞材料复合体中加入含5～15％血清的DMEM培养液，继续培养20小时；3)再向细胞材料复合体中加入成脂诱导的培养基，继续诱导3～5天；4)最后将细胞材料复合体换成含5～10％血清的DMEM培养液继续培养3～5天，即制备成含有诱导的血管内皮细胞和脂肪细胞的工程化脂肪组织，保存备用；所述用于诱导脂肪组织来源干细胞向血管内皮细胞分化的培养基是含2～8％胎牛血清的低糖DMEM或者D/F12，其中加入2～10ng/ml血管内皮细胞生长因子、2～10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、地塞米松、牛血清白蛋白、鸟氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及适量微量元素氯化锌、硫酸锌和氯化锰；所述用于诱导脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞分化的培养基是含有糖皮质激素异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、氢化可的松和可的松中的一种，胰岛素，一种提高细胞内cAMP水平的化合物二丁缩醛-cAMP、8-溴-cAMP和毛喉素中的一种，和/或一种抑制cAMP降解的化合物磷酸二酯酶抑制剂甲基异丁基黄嘌呤或消炎痛。