利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法

摘要

一种利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，主要内容包括：甘露糖筛选体系的建立，基因枪转化和抗性愈伤组织的获得，抗性愈伤组织的分化筛选，抗性苗的获得和生根，抗性再生苗的分子检测和氯酚红法检测法检测pmi基因表达。本发明转化周期短，选择标记系统具有产物安全、选择程序简单、筛选效果显著而且不影响转化植物的代谢平衡等优点，并且检测手段快速、灵敏、可信度高的。利用该技术12周即可获得大量的目标转基因再生苗，解决了转基因安全问题。

主权项

一种利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)抗性植株的获得：切取经消毒处理后直径为0.4～0.8cm，厚为1～2mm的甘蔗新叶，接种于诱导培养基上，于暗室中培养，培养温度为25±1℃，每15d继代一次；选择生长良好的甘蔗胚性愈伤组织作为转基因受体，将构建好的含pmi基因的植物表达载体pUP，利用基因枪转导或农杆菌介导法转化甘蔗细胞；所述诱导培养基的成分为：MS+2，4-D 3.0mg·L-1；所述pUP载体指利用Ubi作为启动子、nos作为终止子、pmi作为标记基因的常规分子生物学方法构建的植物表达载体；MS培养基为植物组织培养的通用培养基；将基因枪轰击后的胚性愈伤组织放入高渗培养基中10～20小时后转入继代培养基中培养2～10天，后转入总碳源为10g的含甘露糖继代培养基中进行筛选，26～28℃黑暗培养10～20天；之后将生长良好的愈伤组织转接到分化培养基中进行分化6～8周，培养12h·d-1，光照度1000～2000Lux，培养温度为26～28℃；待苗长至6～8cm时转接到生根培养基中促根培养，获得抗性植株；所述高渗培养基成分为：MS+2，4-D 2.0mg·L-1+0.2mol·L-1甘露醇+0.2mol·L-1山梨醇；所述继代培养基成分为：MS+2，4-D 2.0mg·L-1；所述含甘露糖继代培养基，指在继代培养基中加入甘露糖和蔗糖，甘露糖取值范围为2g·L-1～8g·L-1，蔗糖取值范围为8g·L-1～2g·L-1，甘露糖与蔗糖总和为10g·L-1；所述分化培养基成分为：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+甘露糖3～4g·L-1+蔗糖7～6g·L-1+琼脂7g·L-1pH5.8；所述生根培养基的成分为：1/2MS+NAA 3.0mg·L-1+6-BA 0.1mg·L-1+蔗糖40g·L-1pH5.8；(2)转基因植株的快速检测：采用氯酚红法，将待测组织接种到含有甘露糖和氯酚红的MS液体培养基中，在黑暗条件下，20～35℃培养1～5d后，观察培养基颜色变化，培养基颜色变成黄色或橙色，则pmi基因已成功导入；所述的含有甘露糖和氯酚红的MS液体培养基中，甘露糖含量为2～5g·L-1、氯酚红含量为30～60mg·L-1。