一种低热原重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)及其高效制备方法

摘要

本发明提供了一种重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)及其制备方法。本发明rhIL-1ra的内毒素含量小于1Eu/mg rhIL-1ra。本发明rhIL-1raa由以下方法制备：a、扩增rhIL-1ra的cDNA序列，构建含编码rhIL-1ra的cDNA序列的重组质粒pBV220-IL-1ra；b、将构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得转化子；c、从转化子表达rhIL-1ra，纯化、除热原即得产物。本发明rhIL-1ra热原低、纯度高、活性强，整体品质优于目前公开的rhIL-1ra。本发明方法步骤简便，成本低廉，热原去除效果可靠，大大提高了产量，是一种优秀的方法，适于大规模应用。

主权项

一种制备重组人白细胞介素1受体拮抗剂的方法，其特征在于它包括以下步骤：a、以具有如SEQ NO.1所示的核苷酸序列的引物1和具有如SEQ NO.2所示的核苷酸序列的引物2，扩增重组人白细胞介素1受体拮抗剂的cDNA序列，再用平端连接的方式，构建含编码重组人白细胞介素1受体拮抗剂的cDNA序列的重组质粒pBV220-IL-1ra；b、将构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得转化子；c、从转化子表达重组人白细胞介素1受体拮抗剂，纯化、除热原即得产物；其中，步骤c中所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂的纯化、除热原过程为：将细菌菌体均匀的悬浮于Buffer A中，高压匀浆破菌，将破菌液离心后弃沉淀留上清液；将所得上清液上用Buffer A平衡好的SP-Sepharose F.F.凝胶层析柱，用Buffer E洗脱，收集目标洗脱峰溶液；将所得洗脱峰溶液超滤脱盐至溶液电导小于2ms/cm，上以BufferA平衡的，串联的DEAE-Sepharose F.F.层析柱和SP-Sepharose F.F.层析柱，样品上完后将DEAE-Sepharose F.F.柱拆下，用Buffer B洗脱SP-Sepharose F.F.层析柱并收集目标洗脱峰溶液，其中串联时DEAE-Sepharose F.F.层析柱在前、SP-Sepharose F.F.层析柱在后；然后将所得洗脱峰溶液上用Buffer B平衡好的Q-Sepharose F.F.凝胶柱，用Buffer B洗至基线后再用Buffer C洗脱3-5个柱床体积，再用Buffer F洗脱，收集Buffer F的目标洗脱峰溶液，超滤浓缩，交换缓冲液成Buffer G，即得；所述的BufferA为5mM磷酸盐缓冲液、pH6.0，Buffer B为20mM Tris.Cl溶液、pH8.0，Buffer C为Buffer B添加0.05M NaCl，Buffer E为Buffer A添加0.5M NaCl，Buffer F为Buffer B添加0.10M NaCl，Buffer G为按重量百分比含0.8％NaCl、0.018％Na2EDTA、0.2％Na3C6H5O7的溶液、pH6.5；上述各次洗脱时的流速为2～20ml/min。