一种藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法

摘要

本发明提供了一种利用电穿孔(electroporation)技术对藤仓赤霉(Gibberalla fujikuroi)进行外源基因的遗传转化方法：利用真菌细胞壁降解酶对赤霉菌的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因/脱氧核糖核酸(DNA)水溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸纳外源DNA，从而实现了外源DNA对赤霉菌的遗传转化。本发明的有益效果体现在：可以用于藤仓赤霉的分子生物学研究，如研究该菌对水稻的致病分子机制以及该菌的生长发育机制等；可以用来对赤霉菌实施基因工程从而进行遗传改良育种，提高赤霉素的合成能力。

主权项

一种藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：1)将藤仓赤霉原生质体用1M山梨醇溶液A悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度为107-108/mL；2)用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至浓度为5～10μg/ul，每100ul原生质体液中加入10～15μgDNA，混匀，冰浴30～40min成混合液；3)在预冷的电击杯中加入步骤2)所得混合液，冰浴5～10min后，用电穿孔仪进行电击，电击参数：电压为850V，电容为25μF，电阻为250Ω；4)电击后电击杯中加入浓度为1M的山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，悬浮后涂布于MYG固体再生培养基平板，28℃培养12h后，于再生平板上覆盖含与所述外源DNA相应的抗生素终浓度50μg/mL的软琼脂MYG再生培养基，在28℃培养至转化子出现；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；所述的MYG固体再生培养基终浓度为：麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述软琼脂MYG再生培养基终浓度为：麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5；5)转化子在含与所述外源DNA相应的抗生素终浓度100μg/mL的软琼脂MYG再生培养基上继代培养，稳定生长后保存，所述软琼脂MYG再生培养基终浓度为：麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5。