猪视黄醇结合蛋白基因(RBP4)真核表达载体的构建

摘要

本发明涉及猪视黄醇结合蛋白基因(RBP4)真核表达载体的构建，从大白猪的肝脏组织的cDNA中，PCR扩增出猪RBP4成熟蛋白编码核苷酸序列，产物全长549bp，即为猪RBP4成熟蛋白183个氨基酸序列。构建了大白猪RBP4成熟蛋白编码序列的真核表达载体pPICZαC-RBP4，经PCR、酶切和测序检测分析，片段大小与理论相符，证明构建成功。可为进一步表达具有生物活性的猪视黄醇结合蛋白奠定基础，也可为深入研究RBP4基因的生物学特性和功能提供一个方便有效的基本材料。

主权项

一种猪成熟肽RBP4基因真核表达载体，其特征在于猪RBP4基因的重组载体：pPICZαC-RBP4，是通过以下方法构建获得的：(1)猪RBP4基因全长cDNA的克隆测序：取猪的肝脏组织，用Trizol试剂提取总RNA，用BcaBEST试剂盒合成cDNA，连入pMD18-T载体，BamH I和HindIII双酶切鉴定后，寄往测序公司测序。(2)RBP4基因转录片段的获得：以PMD18-T-RBP4质粒为模板，进行ClaI和XbaI的双酶切，将酶切下来的片段用胶回收试剂盒回收，用于和pPICZαC的连接反应。(3)pPICZαC质粒的提取、酶切：提取pPICZαC质粒后，进行Cla I和XbaI双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段的回收，-20℃备用。(4)连接：RBP4基因片段和pPICZαC载体片段按3∶1摩尔比例，在T4 DNA连接酶的作用下，4℃16小时进行连接反应。(5)将连接产物转化入TOP10F’菌株，培养基为25μg/ml的ZeocinTM低盐LB培养基，挑选阳性克隆双酶切鉴定。将正确的重组质粒pPICZαC-RBP4送往测序公司测序，检测插入是否正确。