一种农杆菌介导的无抗生素筛选转基因大麦植株的方法

摘要

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的无抗生素筛选培育大麦转基因植株的方法。本发明的要点是，通过农杆菌介导将报导基因manA导入受体大麦细胞中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选；通过磷酸甘露糖异构酶活性调节大麦的遗传转化进程，利用氯酚红显色方法和PCR方法对转基因大麦候选植株作进一步筛选，最终获得高转化率的转基因大麦植株。本发明所采用农杆菌介导遗传转化的大麦栽培品种转化率最高达到12％，用氯酚红显色法筛选转化植株的效率达到100％。

主权项

1.一种农杆菌介导的无抗生素筛选转基因大麦植株的方法，其步骤包括引物设计、PCR扩增、载体构建、遗传转化、筛选鉴定转基因植物，其特征在于，通过农杆菌介导将manA基因导入受体大麦中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过鉴定磷酸甘露糖异构酶活性和PCR检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下：1)设计一对特异引物：PMIP1：5’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’和PMIP2：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’，扩增大肠杆菌manA基因，以该基因为选择标记基因构建植物表达载体pMBL-5，转化根癌农杆菌；2)在愈伤组织诱导培养基上诱导大麦幼胚，得到愈伤组织；3)将步骤2)的愈伤组织转移至预培养培养基上培养5小时；4)将步骤3)的愈伤组织与农杆菌共培养，将共培后的愈伤组织依次转移至恢复、筛选、分化和生根培养基上培养，筛选得到侯选转基因植株；5)用氯酚红显色法检测侯选转基因植株，并将所筛选的候选转基因植株移栽成苗；6)进一步用PCR鉴定移栽后的转基因植株，获得转基因植物；其中：步骤2)所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方制备：愈伤组织诱导培养基：KNO₃ 1900mg/L，NH₄NO₃ 1650mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，MgSO₄·7H₂O370mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂·EDTA 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H₃BO₃22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O1.25mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，甘氨酸2mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 0.5mg/，V_B5 0.5mg/L，脯氨酸690mg/L，肌醇250mg/L，水解酪蛋白1000mg/L，2，4-D 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂6g/L，补充水分至1L，pH5.8；步骤3)所述的培养基按以下配方制备：预培养培养基：以愈伤组织诱导培养基为基本培养基，附加甘露醇72.8g/L，pH5.8；步骤4)所述的培养基按以下配方制备：共培养培养基：以愈伤组织诱导培养基为基本培养基，附加乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8；恢复培养基：以愈伤组织诱导培养基为基本培养基，附加头孢霉素500mg/L，pH5.8；筛选培养基：以愈伤组织诱导培养基为基本培养基，将其中的麦芽糖30g/L修改为10g/L，附加甘露糖20g/L，pH5.8；分化培养基：以愈伤组织诱导培养基为基本培养基，附加头孢霉素300mg/L，同时除去2，4-D 2mg/L，pH5.8；生根培养基：KNO₃ 950mg/L，NH₄NO₃ 825mg/L，KH₂PO₄ 85mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，CaCl₂·2H₂O220mg/L，FeSO₄·7H₂O 13.9mg/L，Na₂·EDTA 18.65mg/L，KI 0.415mg/L，H₃BO₃ 3.1mg/L，MnSO₄·4H₂O 11.15mg/L，ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.125mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.625mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.0125mg/L，甘氨酸2mg/L，V_B1 0.5mg/L，V_B6 0.5mg/L，V_B5 0.5mg/L，脯氨酸690mg/L，肌醇250mg/L，水解酪蛋白1000mg/L，NAA 1mg/L，麦芽糖10g/L，甘露糖20g/L，头孢霉素200mg/L，琼脂6g/L，补充水分至1L，pH5.8；步骤5)所述的方法如下：①制备氯酚红检测培养基；②将步骤①的检测培养基分装至细胞培养板中；③将转基因植株叶片浸入检测培养基中，25℃暗培养4天；④鉴定转基因植物特异颜色反应；其中步骤①所述的氯酚红检测培养基按照下列配方制备：KNO₃1900mg/L，NH₄NO₃1650mg/L，KH₂PO₄170mg/L，MgSO₄·7H₂O₃70mg/L，CaCl₂·2H₂O440mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂·EDTA37.3mg/L，KI6.2mg/L，H₃BO₃0.83mg/L，MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，V_B10.1mg/L，V_B60.5mg/L，V_B50.5mg/L，甘露糖15g/L，氯酚红100mg/L，补充水分至1L，pH6.0；步骤6)所述的方法如下：采用一对特异性引物Primer1正向，5’-GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC-3’和Primer2反向，5’TCCGGCTTGTGGTTAGGATC-3’PCR扩增manA基因特异DNA片段，该片段长度为480bp。