一种定量检测塔玛亚历山大藻的方法

摘要

公开了一种检测待测样品中塔玛亚力山大藻数量的免疫学方法，包括步骤：(a)使固定有塔玛亚力山大藻细胞裂解碎片的固相载体同时与待测样品以及抗塔玛亚力山大藻抗体接触；(b)将固相载体与待测样品和抗塔玛亚力山大藻抗体分开；(c)检测与固相载体结合的抗塔玛亚力山大藻抗体的量，所述固定在固相载体上的塔玛亚力山大藻细胞裂解碎片与待测样品中的塔玛亚力山大藻细胞竞争结合抗塔玛亚力山大藻抗体，而且存在于所述待测样品中的塔玛亚力山大藻细胞数目是根据抗塔玛亚力山大藻抗体与固定在固相载体上的塔玛亚力山大藻细胞裂解碎片结合或不结合的相对程度测定的。还公开了用于该检测方法的试剂盒及其用途。

主权项

1.一种检测待测样品中塔玛亚历山大藻数量的免疫学方法，其特征在于，该方法包括步骤：(a)通过反复在显微镜下挑取单个塔玛亚历山大藻细胞获得纯培养物：所用的培养基是常规的f/2培养基，培养条件为：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lx，培养温度为22℃～25℃；处于对数生长期的塔玛亚历山大藻培养液，用终浓度1.5～2％的甲醛固定后，10000r/min离心10min收集塔玛亚历山大藻细胞，再用蒸馏水清洗一遍，PBS清洗两遍，每步均通过离心收集塔玛亚历山大藻细胞，离心条件均为10000r/min，10min；将所述塔玛亚历山大藻细胞转入1.5ml Eppendorf管，甩去残余水分，-20℃保存备用塔玛亚历山大细胞裂解液；所有所述塔玛亚历山大细胞裂解液用1ml PBS重悬浮，显微镜计数后，取3.2×106的相同细胞量悬浮于终体积1ml的PBS，以所述塔玛亚历山大藻细胞裂解液包被酶标板，每孔50-100微升，4℃过夜或37℃，3-5小时后用1-3％BSA溶液封闭，孵育1-2小时后洗板；(b)使固定有塔玛亚历山大藻细胞裂解碎片的固相载体同时与待测样品以及抗塔玛亚历山大藻多克隆抗体接触：加入待测样品，加入1∶10000塔玛亚历山大藻的抗体稀释液，37℃或室温孵育30-60分钟后洗板，将固相载体与待测样品和抗塔玛亚历山大藻多克隆抗体分开；(c)检测与固相载体结合的抗塔玛亚历山大藻多克隆抗体的量，加入稀释10000倍的酶标二抗溶液，37℃或室温孵育30-60分钟，洗板后加入酶反应底物TMB，孵育10分钟后加入2mol/L硫酸终止反应，读取板上各孔450nm处的吸光值，最后获得的竞争抑制曲线相关方程为：ln(A/(A0-A)＝-1.2941×1g藻细胞数+5.6354，线性相关系数为R2＝0.993，竞争抑制的线性范围在24～6250000个细胞之间，其中A0为最大值，即加入的已知浓度的所述塔玛亚历山大藻梯度稀释液中，藻细胞数为0时的吸光值；A为其它各孔的吸光值。