番红花球茎愈伤组织的诱导与抗肿瘤有效活性成份的提取方法

摘要

本发明公开了一种番红花愈伤组织的诱导培养方法，番红花球茎消毒后切块，在无菌条件下接种于诱导培养基中，在22±1℃暗培养，培养2个月，所述的诱导培养基采用MS为基本培养基，附加成份为6-BA5.0mg/L+NAA 8.0mg/L，蔗糖浓度3％。该诱导方法得到的番红花愈伤组织中可大量提取抗肿瘤有效活性成份。

主权项

1、一种番红花愈伤组织中抗肿瘤有效活性成份的提取方法，包括如下步骤：5-6月份的番红花球茎消毒后切块，在无菌条件下接种于诱导培养基中，在22±1℃暗培养，培养1-2个月，得到番红花愈伤组织；所述的诱导培养基采用MS为基本培养基，附加成份为6-苄氨基嘌呤3～6mg/L和α-萘乙酸7～10mg/L，蔗糖质量百分比浓度2～3％；(1)将番红花愈伤组织用提取液研磨提取，所述的提取液是浓度为50mmol/L、pH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其中还含有浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟、浓度为5mmol/L的二硫苏糖醇，番红花球茎的质量与提取液的体积比为1∶2；(2)将提取液离心分离得到上清液，取上清液加入NaCl固体，使NaCl的摩尔浓度为0.4mol/L；并二次离心去除杂质，得到去除杂质的上清液；(3)将去除杂质的上清液通过层析柱进行分离，上样10ml，层析后用90-120ml洗脱液A洗脱30min，洗脱出A组份，洗脱速度为2.0ml/min；再用100ml洗脱液B洗脱30min，洗脱出B组份，洗脱速度为2.0ml/min；洗脱液A是浓度为20mmol/L、pH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其中还含有浓度为0.4mol/L的NaCl，洗脱液B是浓度为20mmol/L、pH值为8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其中还含有浓度为0.8mol/L的NaCl；(4)将步骤(3)得到B组份过滤脱盐、冷冻干燥后得白色粉末，用LC-304 C-4高效液相色谱柱进行液相色谱分离，检测到保留时间为10.3-14.2min的物质即为具有抗肿瘤效果的有效活性成份，液相色谱分离条件为：流速1.0ml/min，采用波长214nm的UV检测器，流动相为乙腈和水的混合溶液。