联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法

摘要

本发明描述通过将蛋白直接或间接固定在生物相容性磁性纳米材料表面，在液相启动候选配体和参考配体竞争结合达到平衡后，利用磁力回收蛋白-配体复合物，然后变性复合物中蛋白提取所结合配体，用达到所需分辨率和灵敏度的色谱系统分析竞争结合前的样品中和提取的结合配体中候选配体与参考配体的相对峰面积或相对峰高，同时测定各种配体经过磁分离和提取过程后的回收率，在各配体的定量指标显著高于其线性响应截距5倍且处于线性范围内、各配体结合率低于20％的条件下，从而定量测定结合在相同位点候选配体的相对亲和力的方法，可用于未纯化预期配体或组合合成混合物中配体亲和力的测定。

主权项

1、一种以混合物为样品，选用恰当参考配体，经配体竞争结合蛋白上相同活性位点达到平衡，磁力回收蛋白-配体复合物，变性复合物中蛋白并提取所结合配体，色谱分析同步定性鉴定和定量测定参考与候选配体峰面积或峰高，在优化条件下用特定公式从所得峰面积或峰高推算候选配体相对亲和力的方法，其实施步骤包括：(1)以混合物为样品，选择符合要求的内源性配体为参考配体使样品直接作为测定前样品，或选用符合要求的外源性配体为参考配体，并将适量的外源性参考配体加入样品混合物中得到测定前样品；(2)在恒温的缓冲体系加入适量的相应蛋白和适量的测定前样品，混匀后启动测定前样品中各配体对蛋白上相同活性位点的竞争结合直到达到平衡；(3)经磁力物理分离回收蛋白与配体复合物，洗涤去除非特异性结合的物质；(4)加热或有机溶剂或二者同用变性复合物中蛋白并提取所结合配体，适当浓缩；(5)用完全相同色谱系统，分别分析测定前样品和磁分离后提取的所结合配体混合物，同步进行定性鉴定和定量测定各配体的色谱峰面积或峰高；(6)优化步骤(1)中加入的参考配体量、步骤(2)中的相应蛋白量和步骤(2)中所用的测定前样品量以及色谱分析前的稀释或浓缩比例，以满足相应的要求从而可用特定近似公式推算候选配体与参考配体之间的相对亲和力；