竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法

摘要

本发明公开了一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法，本发明采用竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增方法，通过检测反应前后的荧光量，可实现对样品中生物大分子聚合物的定量检测，该方法特异性强、灵敏度高、检准率高。该方法可定量分析细胞的RNA和DNA。本发明竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增方法可在极短时间内完成。本发明方法可用来定量检测样品中的微生物或细胞基因的存在。

主权项

1、一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，按如下步骤进行：(1)将细胞悬浮于生理盐水中，离心，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞，加入样品预处理液200～500μl，剧烈震荡混匀；(2)将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热10～20分钟，冰浴10～20分钟，离心，取上清作为模板DNA；(3)在PCR反应管中加入模板DNA，目标DNA序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为目标DNA；(4)竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；(5)竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；(6)竞争DNA的获得，分别回收纯化竞争DNA序列的上游序列和下游序列，混合后稀释，取5μl作为模板加入到PCR反应管中，然后依次加入上游序列的上游引物和下游序列的下游引物，dNTPs，Taq Plus扩增酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA，稀释后，通过分光光度计测定竞争DNA的浓度C；(7)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，竞争DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算FC，FC＝Fe/Fb；(8)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，Bst DNA聚合酶，目标DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算FT，FT＝Fe/Fb；(9)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，浓度为X的模板DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe；(10)根据以下公式计算模板DNA的浓度Fe/Fb＝FT[X/(X+C)]+FC[C/(X+C)]＝[C(FC-FT)/(X+C)]+FT。