麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法

摘要

本发明公开了一种麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法，包括制备含蛋白干粉的样品缓冲液、第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶条平衡、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶染色和凝胶扫描及图像分析等步骤。本发明采用双向电泳克服了常规HPLC分离法等不能将蛋白质混合液按等电点、分子量分开和无法知道每个蛋白质丰度等缺点，创建了麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离技术，可清楚、直观的呈现每个蛋白质的等电点和分子量以及表达量。

主权项

1、一种麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法，其特征在于包括制备含蛋白干粉的样品缓冲液步骤、第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤、电泳凝胶条平衡步骤、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤、电泳凝胶染色步骤和凝胶扫描及图像分析步骤；其中所述的制备含蛋白干粉的样品缓冲液是将0.5-1.5毫克蛋白干粉溶解在50-150μl含有9M尿素、4％乙基苯基聚乙二醇、2％Ampholine两性电解质和5％巯基乙醇的样品缓冲液中；所述的第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤是配制含3.6％聚丙烯酰胺凝胶、8M尿素、2％乙基苯基聚乙二醇、各2.5％Ampholine两性电解质，pH3.5-10以及pH5-8的凝胶，注入到内径为3mm高度为15cm的玻璃管里，凝胶高度为13cm，之上注入约0.5cm高的蒸馏水，静放2小时以上待凝胶完全聚合之后，吸干凝胶柱顶部的蒸馏水，将玻璃管安装在电泳漕上，取麻疯树种子胚乳蛋白质30μl加于凝胶上端，再用1/2的样品缓冲液覆盖样品；样品端加上0.02N氢氧化钠阴极电泳缓冲液，另一端加上0.02N磷酸阳极电泳缓冲液，连通电源在电压为200V条件下电泳30分钟后，升到400V电压电泳15小时，最后升800V电泳1小时进行蛋白质的等电聚焦；所述的电泳凝胶条平衡步骤是在等电聚焦完成后，将凝胶从玻璃管内取出，置于含有50mM Tris-HCl、10％甘油、2.5％SDS、5％巯基乙醇的平衡液中，在60次/分钟的摇床上摇动15分钟，并重复1次；所述的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤是先配制聚丙烯酰胺分别为15％分离胶和4％浓缩胶的垂直板胶，然后将平衡好的胶条转移到电泳槽垂直胶版的上端，用1％的琼脂糖密封，置于电泳槽上，加满含0.3％Tris、1.44％甘氨酸、0.1％SDS的电极缓冲液，在电流为30mA的条件下电泳约3小时；所述的电泳凝胶染色步骤是在第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤完成后，取下凝胶，置于染色盒中加入100ml含40％乙醇、10％冰乙酸的固定液中，在60次/分钟的摇床上摇动1小时，换上100ml含0.116％考马斯亮蓝R-250、25％乙醇、8％冰乙酸的染色液，在60次/分钟的摇床上摇动1小时；倒出染色液，加入100ml含25％乙醇、8％冰乙酸的脱色液，在60次/分钟的摇床上摇动30分钟，重复3次，得到蛋白点鲜明凝胶电泳图谱；所述的凝胶扫描及图像分析步骤是将考马斯亮蓝染色后的凝胶用UMAX扫描仪在参数为256阶灰度、600dpi条件下透射扫描，所得图像用ImageMasterTM 2D Platinum软件进行分析。