一种PCR方法

摘要

本发明公开了一种具有较高特异性，并且操作简单的PCR方法。该PCR方法，通过模板变性、SiteFinder在低温下与基因组模板退火、单方向延伸，将SiteFinder序列引入基因组序列之中；通过2轮PCR指数倍扩增目标DNA分子，而非目标分子因茎环结构的抑制作用而无法完成指数扩增，从而达到选择性扩增目标分子的目的；通过限制性内切酶识别位点选择性地克隆目标分子；最后，通过已知序列上GSP2下游的GSP3特异性的筛选目标分子。本发明的PCR方法与现有PCR方法相比，具有简单快速、特异性高、通用性强、重复性好、一次扩增片段较长且成本低廉等优点，广泛适用于分子生物学研究中多种目的染色体步查，如转基因动、植物及微生物中外源基因插入位点的鉴定、基因未知区段新基因的分离等。

主权项

1、一种PCR方法，包括以下步骤：1)用SiteFinder起始PCR反应；所述SiteFinder包括46种单链寡聚脱氧核苷酸分子，所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的长度相同，均为50-100nt；所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的3′末端的4至6个脱氧核苷酸组成的序列均相同，紧密连接于该4至6个脱氧核苷酸的5′方向的6个脱氧核苷酸组成的序列均不同，紧密连接于该6个脱氧核苷酸的5′方向的38-90个脱氧核苷酸组成的序列均相同；2)进行巢式PCR反应；所述巢式PCR反应的引物由根据SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根据与待扩增的目标序列相邻的已知序列合成的基因特异引物GSP1，GSP2和GSP3组成；SPF1和SPF2的序列均选自步骤1)的SiteFinder的所述各种单链寡聚脱氧核苷酸分子的38-90个脱氧核苷酸组成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待扩增的目标序列，其次是GSP2，离待扩增的目标序列最远的是GSP1；所述GSP3的3′端第一个脱氧核苷酸与所述已知序列的结合位置，与所述已知序列的3′端最后一个脱氧核苷酸间至少相距5nt。