犬S100β蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种犬S100β蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法，包括提取犬坐骨神经总RNA、RT-PCR扩增、连接、犬S100βcDNA序列的测定、设计S100β表达载体的引物构建S100β重组原核表达质粒、感受态细胞的制备及重组质粒的转化、重组克隆的筛选及酶切鉴定、目的蛋白的表达及多克隆抗体制备等步骤。本发明以PGEX-4T-1为基础所构建的体外S100β表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进行纯化，可方便地获得大量的GST-S100β融合蛋白。另外，经此蛋白免疫大耳兔所制备的兔抗犬S100β血清滴度高、特异好，完全可以满足相关实验的需要。

主权项

1、一种犬S100β蛋白的体外表达方法，其特征是：包括下列步骤：1)取正常毕格犬坐骨神经，用Trizol试剂提取坐骨神经总RNA；2)RT-PCR扩增：用逆转录试剂盒及总RNA进行逆转录反应，合成cDNA第一链，再以合成的cDNA为模板，进行犬S100β基因的PCR扩增；3)连接：用克隆载体试剂盒，将PCR产物连接到克隆载体中；4)犬S100βcDNA序列的测定：将已克隆在克隆载体中的S100β cDNA进行测序，测序结果其序列与基因库中的序列完全一致；5)设计S100β表达载体的引物，构建S100β重组原核表达质粒：以上述测序正确的质粒为模板，PCR扩增S100β基因片断；用限制性内切酶Xho I、BamH I消化S100β的PCR产物和PGEX-4T-1质粒载体，并进行酶切产物的胶回收；用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和PGEX-4T-1质粒载体酶切回收产物连接；6)感受态细胞的制备及重组质粒的转化：用无菌接种棒从感受态细胞菌株蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，细菌培养摇床中37℃、200转/分震荡培养20小时；取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；再4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用；取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中，旋转使DNA分散均匀，冰浴30分钟，42℃水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200μl，于37℃缓摇孵育45分钟，将培养物涂于1.5％含氨苄青霉素的琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16小时；7)、重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，以碱裂解法提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；8)用鉴定正确的重组质粒转化感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB培养基中37℃振荡培养过夜，其中LB培养基中含氨苄青霉素量为50mg/L；将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中，37℃振荡培养至OD600为0.6，取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.1mmol/L，37℃诱导4小时；同时以转化了pGEX-4T-1载体的感受态细胞作阴性对照；将诱导、末诱导的含pGEX-4T-1载体的BL21菌液菌液各1ml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01M PBS 500μl重悬，加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20μl悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况。