| 主权项 |
1.一种规模化提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，包括:一、天然荧光素酶的提取(1)天然荧光素酶的粗提纯取天然萤火虫的虫尾，4℃下按1:2～5体积比加入酶提取A液研磨后，按1:5～8体积比加入酶提取B液，在4℃下以5000～12000r/min离心10～20min，去除上层脂肪和下层沉淀，得到澄清的酶液；(2)天然荧光素酶的硫酸铵分级沉淀4℃下于上述澄清酶液中加硫酸铵至30～40％饱和度，放置2～12h，5000～12000r/min离心10～20min，去除沉淀得到上清酶液，继续加硫酸铵至70～90％饱和度，4℃下放置12～24h，以5000～12000r/min离心10～20min，得到荧光素酶的粗酶沉淀；二、粗酶制剂的纯化(1)复溶与透析荧光素酶的粗酶沉淀加8～10倍酶复溶液，4℃下在酶透析液中透析24～50h，加入3～5倍酶液体积的pH5.8～7.8的50mmol/L PBS，采用5000～12000r/min离心10～20min，去除沉淀得到澄清的酶液；(2)超滤浓缩并更换缓冲液4℃下通过超滤浓缩使酶液体积减少至超滤前的1/8～1/10体积，采用pH5.8～7.8的50mmol/LPBS洗滤；(3)阳离子柱纯化阳离子交换柱的交换介质为SP SEPHAROSE FF，选用直径和长度比为16mm/10cm或26mm/10cm或35mm/32cm；洗脱缓冲液A液为50mmol/LPBS，pH5.8～7.8；洗脱缓冲液B液：洗脱缓冲液A液+2mol/L NaCl，pH5.8～7.8；上样量不超过柱的容量；上样速度1～4mL/min，洗脱速度6～10ml/min，采用线性梯度洗脱或步级梯度洗脱，根据酶活力测试收集酶峰，合并酶液，超滤法去盐；三、荧光素酶的精制(1)一次分子排阻层析经阳离子交换纯化的荧光素酶液，缓慢加硫酸铵至70～90％饱和度，于4℃条件下保存3～10天，5000～12000r/min离心10～20min；酶泥用酶复溶液复溶，酶复溶液的用量为每25克酶泥加入100mL，得到液体酶后上分子排阻层析柱S-200，流速0.8～1.7mL/min，洗脱液为酶复溶液，经酶活检测后收集活力组份，得一次分子排阻层析的纯化酶；(2)亲和层析将上述分子排阻层析纯化酶液导入经酶复溶液平衡好的亲和层析柱HitrapTM 1mL Blue HP或HitrapTM 5mL Blue HP；洗脱液A液为酶复溶液，洗脱液B液为A液+2mol/L NaCl；上样速度：1～4ml/min，洗脱速度：6～10ml/min，采用线性梯度洗脱或步级梯度洗脱，经酶活检测后收集活力组份；(3)二次分子排阻层析经亲和层析柱的纯化酶液，用PEG6000浓缩后，再次上分子排阻层析G-75柱，流速0.8～1.7mL/min，洗脱液为酶复溶液，经酶活检测后收集活力组份得到二次分子排阻层析纯化酶，合并酶液，按体积比1:1加上酶保护剂，冷冻干燥，即得高纯度的荧光素酶；其中，所述的酶提取A液：25mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA—Na22mmol/L PMSF，10％饱和硫酸铵，pH7.8；酶提取B液为：A液组份中不加PMSF；酶复溶液：50mmol/LNaHCO3、10mmol/L Tris、1.0mmol/L EDTA、pH7.8；酶透析液：0.1mol/LNaCl、10～100mmol/L PBS、体积含量为10％的乙二醇、pH7.5；酶保护剂的配制方法:取100～1000mg海藻糖、50～1000mg PEG6000及10～200mg BSA，溶解于10mL无菌蒸馏水中，进行无菌过滤除菌即可。 |
