| 主权项 |
1.一种酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，步骤如下：(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液的制备：选取施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010，常规培养并发酵至NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活达到200～250单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2～4次，再将菌体重悬于pH7.2～7.5、67±3毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体浓度达到5～60克干细胞/升，得到含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液；或者用超声波破碎完整细胞得含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液；(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45～65℃水浴中处理5～60分钟，得到仅含有NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为100～700毫摩尔/升，生物催化剂浓度为1～15克干细胞/升；然后在25～40℃，pH值6.0～8.0条件下，160～200转/分钟振荡10～20小时，进行生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以5,000～10,000转/分钟的转速，离心5～10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以0.5～3倍柱体积/小时的流速上样1～3倍柱体积；去离子水以0.5～3倍柱体积/小时的流速淋洗1～3倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后0.5～2.5摩尔/升盐酸以0.5～3倍柱体积/小时的流速逆流洗脱1～3倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.075～0.095兆帕，温度45～70℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。 |
