优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用。粪肠球菌为肠球菌属中最常见的即为代表种，粪肠球菌生活在人体肠道里，通常对人体不仅无害而且有益。但它有时也会引发严重感染，并对抗生素有抵抗力。本发明将粪肠球菌进行反复培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，并形成规模化生产。其发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤等功能。

主权项

1、优良粪肠球菌的筛选制备方法，其特征在于：所述的优良粪肠球菌的筛选方法如下：在健康人肠道中采集标本，涂布在血平板上，37℃静置培养18-24小时，挑菌落周围无溶血圈的菌落，显微镜观察确认为粪肠球菌后，采用单菌落分离纯化；将分离得到的一系列粪肠球菌培养在下列培养基中：葡萄糖0.5％，胰胨0.4％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，水100ml，pH7.2；37℃静置培养三日后，离心，将上清液或其稀释液叠加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定时间内观察沉淀环的出现及环的厚薄，以判断菌株产生多肽的能力，选择产生多肽能力强的菌株；再将产生多肽能力强的菌株的菌液1ml注射于健康家兔皮内，观察红肿、溃疡的出现，判断菌株毒性大小；最终选择产生多肽能力强，且对实验动物毒性低，细菌及菌落形态较典型的粪肠球菌作为生产菌株；该菌种已于2007年10月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2220；所述的优良粪肠球菌的发酵制备工艺如下：(一)发酵过程：所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用；(1).一级发酵罐：将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；(2).二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐；(二)提纯过程：(1).发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液；(2).浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液；(3).浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置；再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀；这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到粪肠球菌生产的发酵物。