栉孔扇贝G－型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法

摘要

本发明是一种栉孔扇贝G－型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法，属于水产生物技术领域中的贝类分子标记辅助育种技术，其主要内容包括栉孔扇贝G－型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆，抗病和敏感群体的制备，抗病相关G－型溶菌酶基因标记的筛选，抗病个体的快速筛查以及基因标记辅助育种技术的建立。本发明克隆了栉孔扇贝G－型溶菌酶基因的启动区序列，并筛选了其多态性位点。其中－391 AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体，因此，以－391 AG作为栉孔扇贝抗病相关的G－型溶菌酶基因标记，建立了抗病相关基因标记辅助育种方法。本发明具有针对性强、选育效率高、操作简便快捷等特点，适用于贝类抗病相关标记的筛选和抗病优良品种的选育。

主权项

1、一种栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，其特征在于它的技术内容包括以下四个方面：1)栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2)抗病群体和敏感群体的制备；3)抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查；1)栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆：参照分子克隆所述方法从栉孔扇贝闭壳肌中提取总DNA；根据已知的G-型溶菌酶基因序列在其启动子区设计引物，克隆得到一段762个碱基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列；2)抗病群体和敏感群体的制备：采用人工感染的方法获得抗病群体和敏感群体；即从不同海区和养殖场收集栉孔扇贝个体，用病原菌浸泡感染，根据死亡时间判断扇贝对病原菌感染抵抗能力，将扇贝分为抗病群体和敏感群体；3)抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选：对来自5个个体的10个克隆进行了测序，发现了10处多态性位点；PCR扩增42个敏感个体和40个抗病个体的G-型溶菌酶启动区序列后，针对-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G转换分别选用Taq I和Hap II对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，各发现两种基因型，-754II，-754ID，-391AA和-391AG；其中-754ID和-754II个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差别，而-391AA个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，-391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体；因此，将-391AA作为疾病敏感相关的G-型溶菌酶基因标记，而将-391AG作为抗病相关的G-型溶菌酶基因标记；4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查：取栉孔扇贝个体全血1μl作为模版，PCR扩增G-型溶菌酶基因启动区序列，用Hap II对产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳分型后，选择-391AG个体作为抗病个体。